Способ получения иммобилизованных дрожжей Советский патент 1993 года по МПК C12N11/08 A23L3/34 

Настоящее изобретение относится к способу нанесения покрытия, который можно применять для получения иммобилизованных высушенных жизнеспособных микроорганизмов на твердом материале.

В процессе хранения многих потребля-. емых в пищу продуктов под действием кислорода происходит порча пищевых продуктов или напитков. Присутствие кислорода инициирует микробную активность и различные окислительные реакции. Таким путем, насколько известно, кислород оказывает нежелательное воздействие на микробную стойкость и стойкость аромата и вкуса пищевых продуктов, таких как сыр и мясные продукты, соки, кетчуп, и в особенности продуктов, содержащих масло и жир, в частности, маргаринов, орехов и напитков, в частности, пива и вина.

Заявки ЕПВ № 0305005 от 22 августа 1988 г. описывает введение дрожжей в покрытие таким образом, что дрожжи выдерживают пастеризационную обработку и не входят в прямой контакт с пастеризуемым продуктом. Эти дрожжи иммобилизованы в твердом материале, который позволяет воде лишь очень медленно проникать в дрожжи. Когда дрожжи все еще находятся в сухом иммобилизованном состоянии, контейнер с продуктом может быть пастеризован без какой-либо потери активности дрожжей. Дрожжи, которые являются естественным компонентом, в дальнейшем потребляют кислород, вследствие чего образуются двуокись углерода и вода.

Известно, что микроорганизмы, в частности, дрожжи, выдерживают температуру, существенно превышающую 65°С в течение ограниченного периода времени, когда со00

со о «о со

Сл

держание в них влаги составляет всего несколько процентов. Однако, в смоченном состоянии они не способны выдерживать температуру, превышающую 55-60°С, в течение более чем несколько минут без потери всей своей метаболической способности. Следовательно, для того чтобы выдерживать процедуру пастеризации, микроорганизм должен быть практически сухим. В отличие от этого после,зав ршения пастеризационной обработки для активации дрожжей существенно важно их смачивание.

С целью сохранения качества водосо- держащих продуктов во время хранения на такие продукты можно наносить покрытия, содержащие сухие дрожжи, в качестве поглотителей кислорода пищевого сорта. Примерами таких продуктов, которые содержат минимальное количество воды, являются напитки или масла, жиры, продукты, содержащие масло и/или жир.

В описании к заявке на европейский патент ЕР-А-0305005 предлагается удаление кислорода из пастеризованных и непастеризованных контейнеров с использованием дрожжей, которые иммобилизованы восками .и полимерами. При осуществлении такого способа предусматриваются плавление вос- ков или .полимеров, а затем добавление в расплав дрожжей с получением шлама, который наносят в виде покрытия на внутреннюю поверхность материала, в частности, кро- ненпробки. В результате этой иммобйлиза- ционной процедуры дрожжи способны выдерживать пастеризацию и, тем не менее, их рост в продукте предотвращается, поскольку жизнеспособные дрожжи не имеют доступа к продукту.

Основной недостаток вышеописанного способа состоит в том, что при его осуществлении можно использовать лишь ограниченное число восков или полимеров. Они должны не только оказаться в состоянии выдерживать температуру пастеризации, то и также плавиться при температуре, которая не настолько высока, чтобы при добавлении сухих дрожжей в расплавленный воск или полимер они погибли. Более того, воск или полимер должны быть .приемлемы для использования в прямом контакте с напитками или пищевыми продуктами, предназначенными для последующего употребления человеком. Наконец, после нанесения на поверхность этот воск или полимер остается зафиксированным на этой поверхности в те- чение длительного периода времени. Так, в частности, проблемы могут возникнуть из-за

0

5

0

5

0

5

0

5

0

5

закрепления воска или полимера на поверхностях.

Хотя было показано, что этот способ удаления кислорода осуществляется при его применении для пивных бутылок, техническая и технологическая полезность такого способа сужаются рамками вышеописанных ограничений и недостатков,

Было установлено, что покрытия, которые наносят с использованием синтетических макромолекулярных соединений (синтетических полимеров), нашли широкое применение в области нанесения защитных покрытий. При правильном составе эти полимеры характеризуются слабым запахов привкусом и проницаемостью для водяных паров. Примерами синтетических полимеров, которые часто используют для нанесения таких покрытий, являются ПВХ, полистирол и поликарбонат. Однако обычно такие полимеры не могут быть нанесены в соответствии с технологией горячего расплава, В противоположность этой технологии такие полимеры могут быть растворены в приемлемом растворителе с последующим нанесением на покрываемую поверхность в соответствии с одной из обычных технологий нанесения покрытия посредством жидкости. После испарения растворителя получают сухую поверхность с полимерным покрытием. Подобным же образом такие синтетические полимеры используют в форме пленок в пищевой и упаковочной отраслях промышленности для защиты продуктов от влияния внешней среды,

Из литературы известно, что активные дрожжи могут быть экстрагированы органическими растворителями с Целью удалить м из соединений, в частности, из углеводородов и липидов, В ходе проведения такого процесса экстрагирования дрожжевой клети погибают. Таким образом, следует ожидать, что использование органических растворителей при осуществлении любого способа, требующего метаболически активных дрожжей, оказывается неприемлемым. Более того, з хорошо известно в области медицины, что с целью эффективного освобождения поверхности от микробного заражения можно использовать спирт. - В настоящее время совершенно неожиданно было установлено, что применение высушенных микроорганизмов, в частности, высушенных дрожжей, в сочетании с растворителями, которые являются практически безводными, дает возможность выдерживать этим микроорганизмом процесс растворительной обработки в степени, составляющей, по меньшей мере, 10%, обычно 30%, а более типично - 50%, от количества микроорганизмов, которые присутствуют первоначально. Этот факт и лег в основу настоящего изобретения. Количество высушенных микроорганизмов по предпочтительному варианту должно превышать 92 вес. %, предпочтительнее от 94 до 98 вес. %, в пересчете на сухой вес.

Таким образом, в соответствии с настоящим изобретением предлагается способ получения иммобилизованного высушенного микроорганизма, при осуществлении которого предусматриваются приготовление суспензии путем совмещения практически безводного органического растворителя, высушенного микроорганизма и твердого материала, который растворяется в этом органическом растворителе, нанесение на поверхность этой суспензии и удаление растворителя с получением иммобилизованного высушенного микроорганизма в твердом материале, этот микроорганизм представляет собой, например, дрожжи, и твердым материалом служит, в частности, полимер. Такие содержащие растворитель покрытия можно наносить по обычной жидкостной технологии, в частности, опрыскиванием, погружением, посредством кисточки и валика.

В соответствии с одним из вариантов настоящего изобретения предлагается способ иммобилизации сухих дрожжей в полимере пищевого сорта, который дает возможность воде проникать через него только с очень низкой скоростью. В результате большая часть дрожжей в процессе пастеризации остается практически сухой, но увлажняется и. следовательно, становится активной при длительном воздействии насыщенной влагой атмосферы, которая существует в свободном пространстве над продуктом в закрытом контейнере, который заполнен водосодержащим продуктом.

Настоящее изобретение можно применять для иммобилизации дрожжей всех типов, благодаря чему обеспечивается возможность проводить биологические конверсии, в которых дрожжи легко отделимы от субстратов и продуктов. Рост дрожжей предотвращается твердым материалом. Кроме того, рост дрожжей можно предотвратить нанесением на высушенные иммобилизованные дрожжи в твердом материале дополнительного покрытия, которое также препятствует росту.

Хотя настоящее изобретение в дальнейшем изложено с некоторыми подробностями путем иллюстрации и примера с целью ясности и понимания основы применения

дрожжей, предпочтительнее Saccharomyces cerevislae, для удаления кислорода из контейнеров для пищевых продуктов и напитков, любому специалисту в данной области совершенно очевидно, что практическое

осуществление способа настоящего изобретения позволяет использовать дрожжи в других микробиологических процессах, когда необходима иммобилизация на поверх- ности.

Осуществление способа настоящего изобретения позволяет наносить покрытие (из твердого материала) на поверхность, в которую введен высушенный микроорганизм, благодаря чему обеспечивается иммобилизация и защита указанного микроорганизма. По- сле завершения процесса нанесения покрытия по меньшей мере существенная

часть иммобилизованного микроорганизма сохраняет жизнеспособность и способность при смачивании этого иммобилизованного микроорганизма водой или водяными парами осуществлять значительную часть обычных

микробиологических реакций.

Обычно способ настоящего изобретения при иммобилизации высушенного микроорганизма на поверхности проводят растворением твердого материала в органическом растворителе и добавлении в раствор высушенного микроорганизма. Твердым материалом обычно служит полимер. В дальнейшем поверхность покрывают приготовленной таким образом

суспензией в соответствии с обычной жидкостной технологией, после чего растворитель удаляют из суспензии. Таким образом могут быть получены пленки, содержащие иммобилизованные микроорганизмы, Такие пленки или фольгу в настоящее время широко применяют в пищевой промышленности.

Как описано выше, в зависимости от желаемых свойств покрытия в сочетании с

иммобилизованным микроорганизмом можно применять материалы покрытия различных типов. Используемые органические растворители являются практически безводными. Термин практически безводный

означает не содержащий воды, однако, допускающий наличие следов воды. Выбор растворителя определяется материалом покрытия, поверхностью, на которую его наносят, растворителем и способностью его выделяться. Так. например, винилхлоридные полимеры и сополимеры обычно растворимы в ке тонах, они характеризуются различной степенью растворимости в толуоле или ксилоле. Таким образом, термин растворитель служит для обозначения летучей жидкости с достаточной растворяющей способностью, обеспечивающей полное растворение материала покрытия. Важными дополнительными характеристиками этих растворителей являются их токсичность, скорость испарения, температура вспышки, интервал температур кипения, плотность, удельный вес, запах, цвет, кислотность, р содержание нелетучего материала и степень чистоты. Приемлемыми растворителями являются, например, мети- лэтилкетон, метилизобутилкетон, циклогек- сан, хлористый метилен.

Твердый материал, используемый для иммобилизации дрожжей, должен не только растворяться в растворителе, но также и быть приемлемым для введения в прямой контакт с напитками или пищевыми продуктами, когда они предназначены для потребления человеком, то есть материал должен быть пищевого сорта. В том случае, если покрытие используют с другими целями, специалист а данной области должен понимать, что в этих случаях к покрытию предъявляются другие требования. В том случае, если иммобилизованные дрожжи должны выдерживать пастеризацию и применяться для удаления кислорода, такой материал должен обладать приемлемыми свойствами в отношении проницаемости для кислорода, углекислого газа и воды. Необходимо принять во анимание, что в ходе проведения других процессов предпочтительными могут оказаться другие свойства в зависимости от соединений, участвующих в этом процессе. Приемлемые твердые материалы для процесса иммобилизации дрожжей охватывают синтетические полимеры, например, ПВХ, полистирол и поликарбонат. При желании эти полимеры могут быть смешаны с модификаторами. Термин модификатор в данном случае служит для обозначения агента, который улучшает закрепление им- мобилизационного материала на поверхности субстрата.

Специалисту в данной области необходимо иметь-в виду, что следует использовать иммобилизирующий материал, который удовлетворительно прилипает к обрабатываемой поверхности. Часто перед нанесе- нием покрытия существенное значение имеет подготовка поверхности.

Иммобилизирующие материалы могут быть с успехом нанесены в виде тонкого слоя или пленки, содержащей микроорганизм, на упаковочную фольгу или другие

упаковочные материалы, которые с успехом используют для фасовки пищевых продуктов или напитков, а по другому варианту их можно накосить на внутреннюю поверхность контейнеров или поверхность стопоров или пробок для контейнеров, в частности, кроненпробок, нажимных колпачков или головок. При этом может возникать контакт с продуктом, однако, по предпочтительному варианту иммобилизованный микроорганизм должен входить контакт только с газами и парами, которые находятся над продуктом.

После испарения органического растворителя по предпочтительному варианту синтетические полимеры должны обладать ограниченной проницаемостью для водяных паров и, предпочтительно, высокой проницаемостью для газов, в частности,

кислорода и углекислого газа, в тех случаях, когда микроорганизмы способны выдержи- . вать пастеризацию и когда их используют для удаления кислорода. В тех случаях, когда микроорганизмы не должны быть пастеризован, достаточно высокой скорости проницаемости для газов. Для выдерживания операции пастеризации проницаемость полимера для водяного пара по предпочтительному варианту должна составлять ме Нее 100 ед, РНаО, тогда как скорость проницаемости для кислорода должна превышать 0.01 ед. Ркисл. по более предпочтительному варианту проницаемость для водяного пара должна составлять менее 10

ед. РНаО, а проницаемость для кислорода - превышать 0,1 ед. Ркисл. Используемая единица проницаемости Р определяется -как барьер и является стандартной единицей Р, признанной ASTM. Более точно проницаемрсть РНзО определяют как

/куб, см. приЗТР/ /толщина в мм х 10 8/ /кв. см. площади/ /сек/ /см. рт ст./

а единицу проницаемости Ркисл., определяют как

/куб, см. приЗТР/ /толщина в мм х 10 |°/ /кв. см. площади/ /сек/ /см. рт. ст./

при температуре 25°С, как это описано в работе Polymer Permeability Дж. Комийна (Elsevier Applied science Publishers, 1985 г.), стр. 61-63.

В соответствии с одним из вариантов воплощения настоящего изобретения высушенные дрожжи смешивают с растворенным иммобилизирующим материалом, в частности, с синтетическим полимером, после чего эту смесь наносят на внутреннюю поверхность пробки или стопора, посредством которого закрывается сосуд. По предпочтительному варианту в растворитель следует добавлять приблизительно 1-50 вес. % иммобилизирующего материала, а позднее - примерно 0,1 - 30 вес. % дрожжей. Бутылки Ноуадейса часто закрывают с помощью кроненпробок, снабженных полимерным покрытием (например, из поливи- нилхлорида, ПВХ, или полиэтилена, ПЭ) с внутренней стороны см. например Chemical and Engineering News от 8 февраля 1965 г., стр. 43, 44, патент Великобритании № 1211780 и описания к японским патентным заявкам № 48-032086 и 50- 112181. Смесь микроорганизмов и иммоби- зирующего материала можно наносить на поверхность такого покрытия таким образом, чтобы толщина конечного слоя находилась а пределах от 5 мкм до 2 мм и чтобы он был прочно соединен с внутренней поверхностью кроненпробки. Такие слои должны содержать от 0,01 до 160 мг, предпочтительнее от 1 до 40 м сухих дрожжей на каждый квадратный сантиметр покрытия.

Способность поглощать кислород определяют по количеству резервных питательных веществ, которые содержатся в сухих дрожжах. В ходе проведения ферментационной процедуры эти количества резервных питательных веществ можно доводить до максимального уровня. Скорость использования этих резервов зависит от скорости, с которой поступает кислород, то есть, например, чем выше скорость поступления кислорода, тем быстрее расходуется запас дрожжей. Регулирование,количества дрожжей позволяет достичь очень низкого содержания кислорода.Необходимо принять во внимание, что по предпочтительному варианту иммобилизованные дрожжи не должны присутствовать в сколько-нибудь заметном количестве на самой линии уплотнения. Так, например, в случае бутылки с кроненпробкой, снабженной полимерным покрытием, дрожжи не должны присутствовать между краем бутылки и прокладкой кроненпробки.

Перед применением, например в бутылке, кроненпробки, снабженные защищенными дрожжами, по предпочтительному варианту следует хранить таким образом,

0

что при этом исключалось проникновение влаги воздуха, например, в пакетах, содержащих сушильные агенты. Фольгу выгодно хранить смотанной в рулон. При длительном

воздействии влажного воздуха вода постепенно проникает в покрытие из синтетического полимера, вследствие чего содержание влаги в микроорганизме повышается. В результате микроорганизм не

0 способен выдерживать пастеризацию.

Тем не менее часть иммобилизованных дрожжей может оказаться увлажненной в процессе хранения или нанесения. Эта часть дрожжей в процессе пастеризации может погибнуть. Однако было установлено, что это явление оказывается влияние только на внешние поверхностные слои. Гибель внешнего слоя дрожжей даже выгодна, поскольку благодаря этому затрудняется вхождение дрожжей в прямой контакте продуктом, содержащим воду.

В соответствии с настоящим изобретением можно использовать, например, любые

с дрожжи, относящиеся к роду Saccharomyces Kluyveromyces или Schirosaccharomyces.

Существо настоящего изобретения проиллюстрировано с помощью нижеследующих примеров.

оП р и м е р 1. Образцы по 1 г порошкообразных активных сухих дрожжей 96% сухого вещества, Фермипан (Ш), фирма Гист брокэдес и образцы по 1 г прессованных сырых дрожжей 33% сухого вещества, све5 жие хлебопекарные дрожжи смешивали с 0,5 мл не содержащих воды органических растворителей. После инкубирования смесей при температуре 20°С в течение 2 ч и 24 ч соответственно температуру образцов по0 вышали до 37°С, а затем вакуумным выпариванием удаляли растворители. Не содержавшие растворителей образцы суспендировали в 100 мл воды с температурой 30°С, содержавшей 0,85% хлорида натрия.

5 Последовательные разбавления той же самой текучей средой и посевы 0,1-миллилит- ровых образцов на агаре из солодового экстракта, который содержался в чашках Петри, с последующим инкубированием при

0 температуре 30°С в течение 2 дней позволили оценить количество выживших дрожжей, которое присутствует в каждом образце дрожжей - растворителя.

Представленные результаты являются средними величинами, каждую из которых получают по данным трех экспериментов, они приведены в табл. 1. Во всех случаях цифры обозначают общее количество вы

живших клеток на каждый грамм сухого материала дрожжей.

Полученные данные ясно демонстрируют, что растворительная обработка мокрых клеток снижает их жизнеспособность на 3-4 порядка, в то время как аналогичная обработка сухих клеток оказывает на них лишь ограниченное действие. Более того, данные таблицы показывают, что на жизнеспособность (в течение длительного периода времени) высушенных дрожжей не оказывают влияние самые различные органические растворители. Растворитель выбирают исходя из технологических требований,

П р и м е р 2. В ходе проведения экспе- римента данного примера использовали нижеследующие синтетические полимеры:

1)поликарбонат (Макролон 2808, фирма Байер)

2)полистирол (Вестирон 325-31. фирма ХюльсАГ)

&) сополимер полиэтилена с винилацетатом

(Элвакс40- , фирма Дюпон)

4)ЛВХ(8естолитВ 7021, фирма ХюльсАГ)

Образцы по 45 г полимера растворяли з 400 мл хлористого метилена, не содержавшего воды. Объем этого раствора уменьшали выпариванием до 200 мл и добавляли 5 г сухих дрожжей Saecharomyces cerevlsiae, 96 вес. % сухого вещества, а затем перемешивали до образования гомогенной суспензии. Далее суспензию быстро выливали в форму размерами 20x20 см и высотой 1 мм. Форму ставили на кусок фильтровальной бу- маги, которая лежала на стеклянной пластине. С целью ускорить испарение хлористого метилена все количество суспензии заливали в форму в виде трех последовательных порций. В случае использования Вестолита для улучшения условий пленкообразбвания важное значение имело добавление диок- тилфталата. В случае Вестолита В 7021 использовали скорее 30 г полимера и 15 г диоктияфталэта, а не 45 г синтетического полимера. После сушки форму убирали, в результате чего оставался пластический слой, содержавший включенные в него дрожжи и зафиксированный на фильтровальной бумаге.

Препараты дрожж и-синтетический полимер хранили в сухой атмосфере в присутствии силикагеля до использования.

Скорость поглощения кислорода этими препаратами для нанесения покрытий с Дрожжами определяли с помощью стандартных 200-миллилитровых бутылок, объем которых уменьшали добавлением в каждую из бутылок по 90г инертного воска (Дисера 8582). Фактический остававшийся в каждой.

5

5

5

и

5 0 5 0

5

бутылке объем составлял 124 мл. Затем в каждую из бутылок добавляли по 1 мл воды {для создания в закупоренных бутылках насыщенной влагой атмосферы), а также куски по 20 кв. см. приблизительно 2 х 10 см вышеуказанных препаратов для нанесения покрытий с дрожжами. Если производить расчет по количеству введенных дрожжей, то в каждой бутылке содержалось по 0,23 г сухих дрожжей. После введения различных препаратов для нанесения покрытий с дрожжами из бутылок откачали воздух и заполнили их газовой смесью, содержащей 95 об. % азота и 0,5 об. % кислорода. Укупори- ванйе бутылок кроненпробками производили в той же самой азотно-кислородной газовой атмосфере. В сравнительном эксперименте бутылки подвергли той же самой процедуре обработки, однако в них ввели синтетические полимерные препараты в виде кусочков тех же размеров, не содержащих дрожжей.

Для испытания теплостойкости различных содержащих дрожжи препаратов половину бутылок, которые содержали различные препараты с дрожжами, подвергли тепловой обработке в течение 20 мин при температуре 70°С. Другую половину бутылок (и 2 бутылки без дрожжей) не подвергали тепловой обработке вообще. Непосредственно после их тепловой обработки бутылки охладили и оставили храниться в темном месте при температуре 20°С совместно с ней прошедшими тепловую обработку бутылками. После различных периодов времени инкубирования отбирали газовые пробы (по одной пробе из каждой бутылки). В каждой пробе содержание кислорода определяли с использованием метода свободного пространства над продуктом и анализировали с помощью газохроматог- рафической технологии (катарометрическое определение с использованием водорода в качестве газового носителя).

Содержание кислорода в бутылках сравнительного эксперимента, в которые не вводили дрожжи, осталось неизменным, то есть составляло приблизительно 5% в течение по меньшей мере 16 дней, Концентрация же кислорода в бутылках, которые не прошли тепловую обработку, содержащих различные препараты для нанесения покрытий с дрожжами, в среднем за период в течение 6 дней (в интервале 2-9 дней) понизилось до уровня ниже 0,1 об. %. Содержание кислорода в бутылках, которые прошли тепловую обработку в течение 20 мин при температуре 70°С, в течение периода времени в среднем) 10 дней (в интервале 2-16 дней) понизилось до уровня 0,1 об. %, Содержание кислорода в бутылках, которые прошли тепловую обработку в течение 20 мин при температуре 70°С, в течение периода времени в среднем 10 дней (а интервале 2-16 дней) понизилось до уровня ниже 0,1 об. %,

Эти данные ясно показывают, что способность поглощать кислород в сухих дрожжей может выдержать иммобилизацию путем погружения в растворенные синтетические полимеры. Эти данные показывают, кроме того, что препараты с покрытыми дрожжами способны выдерживать тепловые обработки при температуре 70°С в течение по меньшей мере 20 мин.

Формула изобретения 1. Способ получения иммобилизованных дрожжей, предусматривающий приготовление суспензии дрожжей смешиванием

с пищевым полимером, растворенным Б органическом растворителе, и Формирование пленки, отличающийся тем, что для приготовления суспензии дрожжей используют сухие дрожжи с содержанием 92-98 мае. % сухих веществ, которые смешивают С растворенным в безводном органическом растворителе полимере пищевого типа с проницаемостью, не превышающей 100 ед.

Р НаО для водяного пара и не менее 0,01 ед. Р для кислорода, а формирование пленки осуществляют нанесением полученной суспензии на поверхность покрытия с последующим испарением растворителя.

2.Способ по п. 1,отличающийся тем, что используют сухие дрожжи Saccharomyces cerevlslae.

3.Способ по п. 1,отличающийся тем, что формирование пленки осуществляют толщиной от 5 мкм до 2 мм, предпочтительно от 10 до 5000 мкм.

Использование: пищевая промышленность, биотехнология, для удаления кислорода из сосудов с пищевым продуктом и напитком, подвергаемым пастеризации. Сущность изобретения: способ предусматривает приготовление суспензии сухих дрожжей Saccharomyces cerevlsae с содержанием сухих веществ 92-98 мае. % смешиванием с растворенным в безводном органическом растворителе полимера пищевого типа с проницаемостью, не превышающей 100 ед. Р НгО для водяного пара и не менее 0.01 ед. Р для О2, после чего формируют пленку, нанося полученную суспензию на поверхность покрытия, после чего удаляют pacTBOpntenb испарением. 2 з,п. ф- лы. 1 табл.