Изобретение касается получения новой инсектицидной композиции, содержащей Hot ый штамм Bacillus thurlngiensis var. Kurstaki NRRLB-18197 в качестве активного ингредиента.
Инсектицидная композиция используется для борьбы с видами насекомых отряда Met уекрылых, в частности, TRICHOPLUSIA Ml (совка ни), совка капустная и ARTOGEIA RAPAE импортированные мермитиды.
Спорообразующий микроорганизм В. thu inglensls был изолирован свыше 80 лет TON у назад, и с тех пор стал коммерчески изЈвстным в отношении биологической 6of ьбы с вредителями. Спорообразующие клегки В. thuringiensis каждая продуцирует спс ру (эндоспору) и ромбовидный белковый крусталл (параспору или клеточное включение). Энфомоцидные свойства приписываются исключительно б-эндотоксину, который является основным компонентом пар аспорального кристалла. Когда кристалл пер еходит в растворимое состояние в кишке насекомого, он вызывает образование протоксина, который активизируется в результате протеолитического расщепления.
Являясь довольно специфическим видом в отношении Чешуекрылых насекомых и некоторых мух и москитов, В. thuringiensis является безвредной к невосприимчивым отрядам насекомых, животных и человека. В настоящее время в США В. thuringiensis разновидности Kurstaki включает в себя инсектицидные продукты В. thuringiensis наиболее широко используемые для борьбы с этими вредителями. Однако по отношению к этим продуктам отсутствует эффективный контроль на экономических уровнях применения.
С другой стороны, синтетические пи- ретроиды являются химическими инсектицидными агентами, наиболее широко используемыми для борьбы с Чешуекрылыми вредителями. Пиретроиды являются высокоэффективными и обеспечивают более сильные средства борьбы с вредителями по сравнению и с используемыми в настоящее время инсектицидными продуктами В. thuringiensis. Однако недостаток, связанЁ
00
00
VJ
V4 VI
ю
СА)
ный с использованием пиретроидов, состоИТ 9 ТОМ, ЧТО ОНИ ЯВЛЯЮТСЯ ТОКСИЧНЫМИ В
отношении не подлежащих уничтожению беспозвоночных, тем самым представляя опасность для окружающей водной жизни. Поэ гому существует потребность в ,зффекг тивиых инсектицидах, активных против Чешуекрылых, которые безопасны, для окружающей среды, эффективны по стоимости и которые дублируют эффективности синтетических пиретроидов. v
Цель изобретения состоит в получении новой инсектицидной композиции, содержащей новый штамм В. thurlngiensls var. Kurstakl NRRL B-18197 о качестве активного ингредиента, который может быть использован для борьбы з частности с Trichoplusia ni и Asiogeia rapal с насекомыми отряда Чешуекрылых.
Нос ый штамм F3. thuringiensls NRRL В- 18197 был депонирован в Северном Региональном Исследовательском центре департамента сельского хозяйства США, Пеория, ИллиноЛс 61604.
. Новый штамм является спорогенным, крпсталлооразующим мутантным штаммом выделенных из окружающей среды В, thuringiensis и имеет способность продуци- рошпь бипирамидальные кристаллы, состоящие из токсичного белка, и является уникальным в том отношении, что обладает ауксотрофносл ь;о, требующей аминокислотный комплекс лейцина и валина для роста, слсруляцин и продуцирования кристаллов. В противоположность этому.ранее наблю- даемыз штаммы В, thuringiensis проявляли ауксотрофность.не затрагивающую потребность в аминокислотах K.W.Nickerion et al., Appl. Microbiology, 28, 1 1;24-128, 1974,
Для целей изобретения термин ауксот- рофность здесь означает потребность в питательных ееществах, необходимых для роста, споруляции и продуцирования кристаллов микроорганизма.
Фраза аминокислотный комплекс пи- тательной среды употребляется здесь для обозначения питательной среды, содержащей комбинацию двух или более аминокислот.
Новый штамм NRRL B-18197 размно- жен из почпе.чного слоя с использованием неклассического способа отбора посредством ацетата натрия и тепла. В соответствии с этим способом водная питательная среда буферизуется примерно до 0,25 М ацетатом натрия, чтобы допустить размножение только пежелоюпьных спорообразующих организмов, присутствующих в образце окружающего почвенного слоя. Затем выращенные спорообразующие организмы и неспорообразующие организмы в образце убивали путем тепловой обработки. Выжившие споры после этого высеивались на чашки и выращивались на соответствующей агаровой питательной среде для получения нового штамма согласно изобретению. Не прибегая к какой-либо конкретно теории, предполагается, что новый штамм согласно изобретения образуются во время процесса отбора в результате мутагенеза природных штаммов В. thuringiensis с последующей обработкой ацетатом натрия и теплом.
Примером способа селекции является следующий: 0,5 грамма почвы было добавлено в 10 мл L-бульона (100 мл воды, 1 г тритона, 0,5 г экстракта дрожжей, 0,5 г хлористого натрия) в 125 мл.дефлекторной колбе, L-бульон был буферизован до 0,25 М ацетатом натрия. Смесь встряхивалась в течение 4 часов при 250 об./мин. и 30°С. После использования проточного теплового устройства пастеризации смесь нагревалась при 80°С в течение 3 минут. Термооб- работаиная смесь высеивалась на чашки с L-агаром (L-бульон, отвержденный с помощью 1,5% агара) и инкубировалась в течение ночи (16 часов) при 30°С.
Штамм NRRL B-18196 имеет следующие характеристики: колонии являются круглыми, цельными, выпуклыми и кремового цвета с диаметром колонии 2-7 мм на питательном агаре после 24 часов. Вегетативные клетки являются аэробными, грам- положительными, подвижными палочками размеров 1-1,2 мкм на 3-5 мкм. Концевые (верхушечные) споры вегетативных клеток не раздувают спорангий и составляют от 33 до 50% вегетативных палочек. Клетки являются положительными по катализе фермента глюкозы гидролизу казеина, но вопреки таксономическому описанию прежде наблюдаемых штаммов В. thuringiensis, штамм согласно изобретению не использует цитраты. Новый штамм не ферментирует маннит, арабинозу и кислозу.
Дополнительно штамм NRRL B-18197 гидролизовал крахмал, использовал эску- лин, продуцировал лецитиназу и ферментировал салицин; клетки не продуцировали уреазу и не ферментировали маннозу или сахарозу. Штамм является стойким по отношению к антибиотикам пеницилинового типа, к таким как нафициллин и метициллин, м является стойким по отношению к низким уровням, т.е. около 10 г/мл, неомицина, ка- намицина и бромида этида, Как сказано выше, продуцирование спор и белковых кристаллов В. thuringiensis NRRL B-J8197 требует водной питательной среды, которая содержит лейцин-валиновый аминокислотныС комплекс. Для оптимального образо- вания кристалла бактериями согласно изобретению предпочитаемый состав специальной питательной среды следующий:
{ триптона, 0,2 % триптозы, 0,45 % дрож- ого экстракта, полученного из буфера фата натрия 0,01 М при рН 6,8 с добав0,3 же фо MgSCM и MnS04 после
,-9
обр
аботки в автоклаве. Примером предпочтит льной среды роста является среда ТЗ, содержащая следующие ингредиенты: 0,3% триптона, 0,2% триптозы, 0,15% дрожжево- кстракта (или 0,65% пептона Bacillus), 1 М натрий фосфатного буфера с рН
,0,01% 1 М сульфата магния и 0,001% 1
го
10 6,
М фльфата марганца. Продуцирование клеток производится в аэробных условиях при лю ой температуре, удовлетворительной
для
ни
чи
27
ды
кул
но
яв/
но
пр
cot
де
ни
ле(
ку;
ваь
роста микробов. Согласно изобрете- ), т.е. примерно от 10°С до 40°С; предпо- аемый диапазон температуры между С и 32°С. Величина рН питательной сресоответствующей для выращивания
туры В. thurlnglensls близка к нейтраль- ти, т.е. рН от 6,7 до 7,2. Время инкубации яется временем необходимым для пол- о освобождения спор и кристалла и дпочтительно составляет от 18 до 24 ча- , Клетки могут выращиваться в любой лекторной встряхиваемой колбе в тече- небольших опытов. Для операций в бо- крупных масштабах удобно выращивать -.туру в резервуаре, применяя помеши- ие и аэрацию в отношении инркулиро- ваАной жидкой питательной среды. После ин субации клетки собираются традици- он шм способом седиментации, как, на- , центрифугированием или фильтрованием. Клетки могут использо- ва ься как таковые или в замороженном ви- де для последующего использования. Штамм вы держивают при 30°С и 250 об./мин в 2-х ли ровых конических колбах Эрленместера с т юйными перегородками при объеме 25% и хранят при температуре 25°С на среде ТЗ, от|ержденной 1,5% агаром.
Чтобы получить инсектицидную компо- зи ию с В. thuringiensis var. Kurstakl NRRL В- 8197 в качестве активного ингредиента штамм, составляющий до 30% общего объ- емз смешивают с инертными ингредиентами, которые составляют оставшийся объем, ъе. по крайней мере, 70% объема. Инерт- ньи ингредиент может быть разбавителем, ка с, например, вода. Другие инертные инг- ре :;иенты представляют консерванты, агенты, регулирующие текучесть, агенты, способствующие прилипанию, спредеры, Э№ульгаторы, поверхностно-активные вещества, экстендеры и буфер. Используемый
5
5
0
0
5 0 5 0 5
0
5
интервал доз для штамма составляет от 1,1 х 1010до5х 1012 спор на 0,405 га. Инсектицид, содержащий мутант В.thurlnglensls NRRL B-18197 в качестве активного ингредиента в указанных дозах, является высокоэффективным в уничтожении насекомых отряда Чешуекрылых, в частности совки капустной и импортированными мермитида- ми (см. таблицу).
Пример способа получения инсектицидной композиции включает смешение - через воздушное измельчение для обеспечения частиц определенного размера и гомогенности - штамма NRRL В-18197, составляющего до 30% общегд объема, с инертными ингредиентами, которые составляют оставшийся объем. Эти инертные ингредиенты включают консервант, 2 поверхностно активных вещества, агент, регулирующий текучесть, разбавитель и буфер. Смесь затем гранулируется и упаковывается в герметичные и влагонепроницаемые контитперы. Инсектицидные композиции могут распыляться с использованием соответствующих методов распыления и устройств. Новый инсектицид также может быть инкапусилиро- ван или заключен в соответствующий инкапсулирующий материал, такой как органический полимер, и применяться в порошковой форме. Также предусматривается, что генетический материал для дельта- эндотоксина нового штамма В. thuringiensis NRRL B-18197 может переноситься с помощью техники рекомбинантных ДНК в другие бактерии и растения для обеспечения усиленной борьбы против вредителей. Лзо- бретение иллюстрируется следующим примером.
П р и м е р. В полевых испытаниях эффективность инсектицида, содержащего в качестве активного ингредиента NRRL B- 18197, в отношении совки капустной и импортированных мермитидов сравнивалась с эффективностью синтетического инсектицидного продукта, содержащего пиретроид ПИДРИН (Pydrln) и инсектицидный продукт В. thuringiensis разновидности Курста- ки ДИПЕЛЬ (Dlpel). ПИДРИН является товарным знаком продукта, продаваемого фирмой Шелл корпорейшен, и содержит 30% циано (3-феноксифенил)метил-4-хлор- альфа(1-метил)бензолацетата и 70% инертный ингредиентов. ДИПЕЛЬ является товарным знаком продукта, продаваемого фирмой Абботт лабораториз и содержит 3,2% В. thuringiensis разновидности Кур- стаки и 98,8% инертных ингредиентов. Также испытывались две других инсектицидных композиции, содержащих в качестве активных ингредиентов В. thurlnglensls
var. Kurstaki NRRL B-18195 и В. thuringiensis var, morrisoni NRRL B-18196. Инсектициды, содержащие в качестве активных ингредиентов новые штаммы NRRL В-18197, В- 18195 и В-18196, содержали 5,5 х 109 спор на 0,5 л воды, 0,01 % общего объема составлял жидкий детергент (добавленный как спредер) и остальной объем составляла вода.;
На Восточном Берегу Мэриленда капу- ста листовая была прямо высажена семенами в 4-рядных делянках по 30,48 см длины 07 июля 1986 г. Растения отстояли друг от друга на 5 см в ряду и 91,5 см между рядами. Обработки были организованы по схеме рандомизированных блоков с 4 повторами. Каждый ряд был буферизован защитным рядом. Почва была супесчаной почвой Норфолк А. Все обработки опрыскиванием включали 5,5 109 спор в 0,5 литров воды, в которую добавлялось 0,01 % жидкого детергента в качестве распыливающего вещества (спредера), Опрыскивания производились с помощью садового опрыскивателя тромбо- нового типа, калиброванного для подачи 113,55 л состава на 0,405 га.
Ряды обрабатывались опрыскиванием 11,18 и 25 августа и 2 сентября и 8 сентября. 15 сентября производились оценки повреж- денной листвы и количества насекомых. По- вреждения вследствие естественно происходящего нашествия совки капустной и импортированных мермитидов было умеренным. Оценки повреждения листвы были в диапазоне от 1-5 и индексировались следующим образом: (1) 0-3% повреждения - случайные отверстия на листьях; (2) 4- 10% повреждения - несколько листьев с отверстиями; (3) 11-25% повреждения - среднее/умеренное число листьев с отверстиями; (4) 26-50% повреждения - большинство листьев с отверстиями; и (5) 51-100% повреждения - повреждение корневой шейки и/или все листья с отверстия- ми.
Данные анализировались методом дисперсионного анализа, и средние значения выделялись с помощью испытания множественного ряда Дункана (DMRT) при Р 0,05 уровня (Дункан 1951). Результаты приведены в таблице ниже.
Таблица ясно показывает отличные инсектицидные свойства нового штамма согласно изобретению в отношении совки капустной и импортированных мермитидов. Штамм В. thuringiensis В-18197 обеспечил статистически ту же защиту капусты листовой, как и ПИДРИН. Инсектицидные композиции, содержащие штаммы NRRL В-18195 и NRRL BH8196, в качестве активных ингредиентов, показывающие идентичные уровни защиты от совки капустной и импортированных мермитид в выражении среднего повреждения листьев, являются статистически менее эффективными, чём ПИДРИН. Однако эти инсектициды обеспечивают 10-кратное увеличение активности по сравнению с промышленным инсектицидом В. thuringiensis ДИПЕЛЬ. Такое увеличение хорошо демонстрировалось, когда обработки веществом ДИПЕЛЬ показывали идентичный уровень борьбы (повреждение менее 10%), как и штамм В-18195 при разбавлении 1:10 первоначального состава.
(1)Любые два числа в одной и той же колонке с последующей той же буквой значительно не отличаются (Р 0,05) DMRT.
(2)Распыление производилось 11,18,25 августа и 2, 8 сентября.
(3)Вред, причиненный, главным образом, совкой капустной и импортированными мермитидами.
(4)ДИПЕЛ 7,26 миллиардов международных единиц на 373,2 г.
(5)Калибровано по выходу 7,26 миллиардов международных единиц на 373,2 г,
Формула изобретения Штамм бактерий Bacillus thuringiensis
var. Kurstaki NRRL В-18197 для получения
инсектицидного препарата.
Продолжение таблицы
Использование: производство инсектицидных препаратов. Сущность изобретения: штамм бактерий Bacillus thuringiensis var. Kurstaki выделен из окружающей среды. Депонирован в Северном Региональном Исследовательском центре департамента сельского хозяйства США, Пеория Иллинойс, под № NRRLB-1897. Штамм обладает ауксотрофностью, требующей аминокислотный комплекс лейцина и валина для роста, споруляции и продуцирования кристаллов. 1 табл.
(1)
Среднее количество
совки капустной на
10 растений, 15сентября
В. thuringlensis
В-18195(5) В. thurlngiensis
В-18196(5)
1/10 В-18195(5)
Дипел 376,93 г (4)
Необрабатываемая
контрольная грядка
(1)
Среднее количество мермитид импортированных на 10 расте- ний, 15 сентября
(1,2.3)
Средняя оценка повреждения листвы 15 сентября
2,00 b
2,00 b 2,75 ede 2,50 bee
4,0 g
