способностью продуцировать нитрил-гид- ратазу.
Давление, по крайней мере, одного из соединений: мочевины и производных мочевины формул (I)-(III); и иона кобальта и культуральную среду во время культивирования бактерии Rhoclococcus rhodochrous значительно повышает нитрил-гидратазную активность указанной бактерии на единицу культура ль ной жидкости.
Это повышение нитрил-гпдратазной активности на единицу культуральной среды, вероятно, ведет к увеличению концентрации клеток (т.е., выходу) и/или клеточной активности (т.е., количеству нитрил-гидра- тазы в клетках);
При осуществлении настоящего изобретения добавление мочевины или ее производного особенно эффективно для повышения клеточной активности. Подробное описание изобретения 1. Бактерии Rhodococcus rhodochrous В настоящем изобретении используются бактерии Rhodococcus rhodochrous, обладающиенитрил-гидратазнойактивностью и способностью к гидратации нитрилов, в частности, ароматических нитрилов, до получения соответствующих амидов. Конкретным примером таких бактерий является штамм 1-1 (FEPM ВР-1478) - Rhodococcus rhodochrous, описанный в заявке на японский патент № 231744/1988 и в заявке на патент США № 243936, упоминавшихся выше. Ниже приводятся подробное описание указанного штамма 1-1. взятые из цитируемых заявок на патент.
1. Происхождение и депониросание Штамм I- был выделен заявителями из почвы в Сакис-кю, Киото, Япония, и депонирован 18 сентября 1987 г. Институтом Ферментных исследований, Агенством прикладных наук и технологии, Министерством международной торговли н промышленности Японии, где он находится на хранении под номером допуска ГЕРМ ВР- 1478 в соответствии с Будапештским договором.
2. Бактериологические характеристики (а) Морфологические характеристики (2) Форма и размер клетки: 0,9-1,0 мк х 3-10 мк
(2) Полиморфизм: удлиненные клетки, имеющие форму палочек, в начальной стадии культивации растут до образования прямых палочек с изломом, а затем делятся, образуя короткую бациллярную форму 3) Подвижность: Неподвижны
(4) Образование спор: не образуют
(5) Окрашивание: положительно
(6) Кислотоустойчивость: отрицательно
(7) Гетерофильный гранулоцит: наблюдается
(Ы Культурзльные характеристики различных культуральных сред 30°С
(1) Бульонная культура на чашках Петри с агаром: круг с диаметром 1 мм (48 часов), неправильный, довольно сухой на поверхности, плоский, непрозрачный, и бледно- оранжево-розового цвета.
(2) Бульонная культура на скошенном агаре: волокно с гладкой поверхностью и слегка выпуклой, довольно сухое в поперечном сечении и бледно-оранжево-розового цвета.
5(3) Бульонная культура о жидкой среде: обильный рост с образованием мембраны. Культуральнпя жидкость становится довольно мутной и образуется преципитат в результате роста клеток
0 . (4) Бульонная культура из .столбиках желатины: хороший рост на поверхности в виде соронки вдоль поверхности столбика, но на нижней поверхности рост ограничен. Желатин не разжижен.
5(5) Лакмусовое молоко: бе.з изменений. (с) Физиологические озойствз:
(1) Снижениз нитрата: положительно
(2) Денитрификация: отрицательно
(3) MR - тест: отрицательно 0(4) VP - тест: отрицательно
(5) Образование индола: положительно
(6) Образование ссроиодореда: положительно
(7) Гидролиз крахмала: отрицательно 5(8) использование лимонной кислоты:
культурзльн;1Я среда Косич: отрицательно
культуральноя среда christeuseu: положительно
0(9) Использование неорганических источников азота:
нитрат: положительно
соль аммония: положительно
(10) Образование пигментов: отрица- 5 тельно
(11) Урсэзэ: положительно
(12) Окскдаза; отрицательно
(13) Каталаза: положительно
(14) Гидролиз целлюлозы: отрицательно 0 (15) Условия роста: рН: 5-10 температура: 10-41°С
(16)-Реакция на кислород: аэробная
(17) Разложение тирозина: положительно
(18) Разложение аденина: положительно 5(19) Фосфотазь: положительно
(20) Гидролиз Тонна 80: положительно
(21)0-Р-тест: О (слабый)
(22) Термостойкость (в 10% сепарированном молоке при 72°С в течение 15 мин) отсутствует
(23) Образование кислоты и газа из сахарида:
КислотаГаз L-Арабиноза D-Ксилоэа D-Глюкоза + D-Манноза - . - D-Фруктоза + Мальтоза + Сахароза + Лактоза Трегалоза D-Сорбит + D-Маннит + Глицерин +
(24) Рост в одном источнике углерода: Инозит
Мальтоза4 D-Маннит + Рамноза
D-Сорбит+ т-оксобензойная кислота + Адмпат натрия + Бензоат натрия + Цитрат натрия . + Лактат натрия + Тестотетрон + L-Тирозин . + Глицерин (1 %) (вес/об,) (+) Трегалоза (+) р-оксибензойная кислота (.1%) (вес/об.) + (+): слегка положительно
(25) Анализ жирных кислот и клеточной стенки: клетка содержит ненасыщенные и насыщенные с прямой цепью. ТСХ миколо- вой кислоты дает хроматограмму с единичным пятном.
Согласно оценке вышеперечисленных бактериологических свойств в соответствии с Руководством по систематической бактериологии Берги (1986), штамм 1-1 является аэробной, Грамположительной, обладающей слабой устойчивостью к кислотам, ката- лазо-положительной и не образующей эндоспор палочкой без жгутиков. Этот штамм имеет форму продолговатой палочки и мицелий о начальной стадии роста, растет с ветслением, а затем делится с образованием коротких палочек. В соответствии с указанными признаками, штамм (-1 подпадает под тип бактерии Nocardia.
Анализ на состав жирных кислот обнаружил, что бактерия содержит ненасыщенные и насыщенные жирные кислоты с прямой цепью, включающих туберкулостез- риновую кислоту. Поскольку ТСХ миколовой кислоты дает единичное пятно, имеющее такое же значение Pf как и стандартная бактерия Rhodococcus rhodochrous (IFO 3338), эта бактерия не является бактерией рода Мусо bacterium. Эта бактерия также отличается от бактерии Nocordia по составу (числу 5 атомов углерода) миколовой кислоты,
В результате исследования других биохимических свойств указанная бактерия била идентифицирована как Rhodococcus rhodochrous. 0 II. Мочевина и ее производные
В соответствии с настоящим изобретением, мочевина и производные мочевины, имеющие формулы ()-( II); как было указано выше, выполняют функции индукторов фер- 5 ментов. Может показаться совершенно неожиданным, если учесть тот факт, что до - настоящего времени типичными индукторами ферментов считались нитрилы или амиды, например, кротонамид, что мочевина и 0 ее производные могут эффективно индуцировать нитрил-гидратазу. При этом было обнаружено, что мочевина и ее производные если и использовать не в комбинации с другими индукторами ферментов, а отдельно, 5 показывают значительно более высокую эффективность, чем стандартные индукторы ферментов. Кроме того, мочевина является менее дорогостоящим продуктом по сравнению с другими индукторами, но с эконо- 0 мической точки зрения способ настоящего изобретения может быть с успехом применен в промышленности.
Примерами соединений формулы (I), используемых в настоящем изобретении мо- 5 гут служить метилмочевина, этилмочевина, 1,1-диметилмочевина и 1,3-диметилмочеви- . на.
Примерами соединений формулы (II) являются уретан и метилуретан, 0 Примером соединения формулы (III) является тиомочевина.
Мочевина или ее производные добавляются в культуральную среду в один прием, разом, или последовательно. Термин по- 5 следовательно в данном, случае означает непрерывно и с возрастанием. (Ill) Ион кобальта
Нитрил-гидратаза не может быть получена просто добавлением мочевины или ее 0 производных в культуральную среду, и добавление в культуральную среду иона кобальта является важным фактором настоящего изобретения. (Присутствие иона кобальта является важным для полу;е- 5 нйя нитрил-гидратазы при помощи бактерий, как было предложено в упоминавшихся ранее патентных заявках N; 231744/1086, Япония и № 238986, СЩА).
Обычно, ион кобальта образуется при добавлении водорастворимого соединения
кобальта в водную культуральную среду. Водорастворимые соединения кобальта описаны в химических энциклопедиях, и поэтому специалист может легко выбр ать для использования одно из наиболее подхо- дящих соединений.
Типичными примерами кобальтовых соединений являются соединения, которые дают Со или Со+++, особенно, Со, такие как хлорид кобальта, сульфат кобальта, аце- тат кобальта, бромид кобальта и бора кобальта.
Кроме того, о качестве источника кобальта могут быть использованы витамин В12 и металлический кобальт. Витамин Bi2 содержит кобальт в виде комплекса, который может быть ионизован при помощи об.- раб.ртки в автоклаве, а металлический кобальт может быть ионизован посредством ионизирующей функции микроорганиз- мов во время культивации.
(IV). Культивирование/получение нит- рид-гидратазы
Бактерия Rhodococcus rhodochrous в соответствии с настоящим .изобретением может культивироваться при любых условиях, соответствующих целям настоящего изобретения, за исключением того, что в культуральную среду добавляются мочевина или ее производные и ион кобальта.
Например, заранее определенные количества мочевины или ее производного и ионы кобальта добавляют в основную питательную среду (описание основных сред см.ниже) и культивируют при температуре около 15-50°С, предпочтительно, около 20 45°С, а более предпочтительно, около 30°С, при рН от 7 до 9, в течение 30 часов или более, предпочтительно, в течение 40 часов или более (до, например, 120 часов).
Общая концентрация мочевины или ее производных в культуральной среде составляет около 1-30 г/л, предпочтительно, около 2-20 г/л, а более предпочтительно, около 5-15 г/л, тогда как концентрация ионов ко- бальта составляет около 5-15 мг/л (расчет проводился исходя из CoCte).
Основная питательная среда:
Культуральная среда А
Компонент Количество (в 1 л среды)
К2НР0413,4 г
КН2Р046,5 Г
NaCI1,0 г MgSOi7H20 0,2 г Витаминная смесь 0,1мл Дистиллированная остальное кол-во смесь (рН 7,0) Состав (в 1л раствора): Биотип 2,0 мкг
Пантотеиат кальция 0,4 мг
Инозит2,0 мг
Никотиновая кислота 0,4 мг
Гидрохлорид тиамина 0,4мг
ПиридоксингидрохлориД0,4 мг
р-Аминобеизойная
кислота0,2 мг
Рибофлавин0,2 мг
Фолиевая кислота0,01мг
Дистиллированная
водаостальное кол-во
Культуральная среда В
К2НР04 0,5 г
КН2Р040,5 г
MgS04 7H200,5 г
Дрожжевой экстракт -3,0 г
Дистиллированная остальное кол-во
. вода(рН 7,2) Культурэльная среда С Глюкоза 10 г К2НР04 0,5 г КН2Р04 0,5 г MgS04 7H20 . ,0,5 г Дрожжевой экстракт 1,0 г Пептон 7,5 г Дистиллированная остальное вода кол-во (рН 7,2) V. Экспериментальные примеры Изменение и определение феоментно.й
активности
(1) Метод измерения нитрил-гидратаз- ной активности
Нитрил-гидратазную активность определяли следующим образом.
2 мл реакционного раствора, содержащего 1,0 мл бензонитрила (20 мм), 1,0 мл 3-цианопиридина (1 М)или 1,0 мл акрилнит- рила (1 М) в качестве субстрата; 0,5 мл калий-фосфатного буфера (0,1 М, рН 7.0); и заранее определенное количество бактериальных клеток (выделенных из культуральной жидкости), подвергали реагированию при 20°С в течение заранее определенного периода времени, а затем завершали реакцию добавлением 0,2 мл 1 н HCI.
(2) Определение нитрил-гидратазной активности
Ниже приводится активность, определенная в случае специфической активности С.А. и в случае общей активности О.А.:
С.А. мкМ амид/мг-клетки/мин
О.А. мкМ эмид/мл-культуральная среда/мин
Пример 1. Заранее определенное количество мочевины добавляли в описанную выше основную среду С, содержащую 10 мг/л CoCl2. К каждым 60 мл полученной культуральной среды добавляли 4 мм прекультуралыюй жидкости, содержащей Rhociococcus rhodochrous, штамм 1-1 (FEPM ВР-1478) полученной с использованием основной среды С, и культивировали, при этом встряхивая, при 28°С в течение 96 часов,
В целях сравнения, аналогичное культивирование проводили в среде, содержа- .щей либо мочевину, либо CoCl2 в отдельности,
Полученные результаты систематизиро- ваны в таблице 1.
Результаты, приведенные в таблице 1, показывают, что добавление мочевины в сочетании с CoCl2 яоляетсл крайне важным для увеличения проду роознил нитрил- гидрэтазы.
Пример .. Штзм И подвергали культивированию в сеотоетстрии с описанием Р. Примере 1, при 28°С. п течение 3-120 часов, п основной с радо С, в присутствии 10 мг/л CoCI, добавляя или не добавлял заранее определенное количество-индукторов ферментов (мочевину и КРОТОНЭММД). к,к показано я таблице 2,
Значения С А. и О.А., приведенные в таблице 2, были получены при максимальных значениях С.А. во время измерений активности.
Как випно ..з таблицы: пспольгоелние в качестве кндуктора фермента лишь одной мочезины без крптон,мчдя приводит к значительному увеличению продуцировании нитрил-гидрэтаз.ы.
Пример 3. Заранее определенное количество произеодкых мочевины доб-ЗЕ)- ляли в основную среду.С. содержащую 10 мг/л CoCi2. К каждым GO tf.n полученной культурэльной среды добавляли -4 мл про- культуральном жидкости, содержащей Rhodococcur, rhodoclirous, гшзмм 1-1 (FEPM ВР-14.78} полученной с использованием основной среды С. 11 культивировали, потряхивая, при 28°С п течения 96 ЧЗСОЕ.
В целях сравнения, аналогичное культипи- рование проводили в среде, содер ащей либо метилмочевину, либо CoClz по отдельности.
Результаты приведены в таблице 3, в которой значения С.А. и О.А. были получены
при максимальных значениях С.А. во время измерения активности, В этой таблице добавлены для контроля результаты, полученные для 7,5 г/л мочеоины.
Результаты, приведенные в таблице, показывают, что добавление производного мочевины и СоС(2 ведет к значительному повышению продуциропания нитрил-гидратазы.
Формула изобретения
1. Способ культивирования бактерий - штамма Rhociococcus rhodochrous. продуцирующего нитрил-гидратазу на питательней среде н присутствии индуктора фермента .при оптимальных условиях биосинтеза, о т- л и ч а ю щ и ft с я тем, что, с целью повышения активности нитрмл-гидрэтэзы, в качестве штамма используют Rhociococcus rhoiioc.hrous 1-1 FHRM BP № 1/178, а г исходную питательную среду дополнительно вносят источник иочоп кобэпы а и используемые в ха ептпс икдукторо фор- мен га мочаги ну илм проиополноо мочеу.ины формулы (П. (М) и (II)
RiR.NCONR2R4(I) где RI, R2, Нз и R х.аждыО является -Hi-СНз или . т исключением того, VTO зсо зз- местители не пплпются -М;
Rr RoNCOOC2H
00
где RS и RG кач/дый .- рляетс.ч -Н; -СНл или Csh s;
NH.CSNH2 (ill)
., Способ по п.1, о т л w ч э ю щ и и с Р тем, что концентрацию мочэв лны или ое проилподнык в питательной средо устаи е- лиоают от 1 до 30 г/л.
3. Способ по п.1, о т л л ч V ю 1ц и & с я тем, что источником /опои ксбзлыл япляег- ся хлористый кобальт в концентрации от Г до 15 мг/л.
Приоритет по признакам:
06.10.88 - признаки пунктов. 1, 2, 3, рас- крыолющие использование культурлльной среды, содержащей одновременно коны кобальта /. МОЧСЕМНу.
23.02.89 - признаки пунхтогз 1,2,3, ргскры- ааюш.ие использование хультургшьной среды, содержащей одновременно ион кобальта и производные мочевины формул 1, 2, 3.
Продолжение табл.1
Таблица 2
Т-а блица 3
