Способ твердофазного культивирования мицелиальных грибов Советский патент 1993 года по МПК C12N1/14 C12N1/14 C12R1/845 

Изобретение относится к биотехнологии и может найти применение при получе- нии целевых ферментов в процессе выращивания на твердой питательной среде.5

Известны способы поверхностного выращивания микромицетов на твердой питательной среде, включающей пшеничные отруби с добавлением добавок - индукторов биосинтеза и добавок-рыхлителей для по- IP вышения выхода целевых продуктов 1.

Недостатком этого способа является невозможность .значительно увеличить выход ферментов из-за ограниченности высоты, питательного слоя, затрудняющего 15 аэриррвание культур.

Наиболее близким по технической сущности к изобретению является кювётный способ твердофазного культивирования целиальных грибов, включающий стерили- 20 зацию увлажненных до 58-68% пшеничных отрубей (возможно добавление 5-20 % до- бавок-рыхлителей), инокулирование посевным материалом с содержанием спор не менееО,7млрд;в1 г, тщательное перемеши- 25 вание компонентов, раскладывание в кюветы высотой слоя 2-2,5 см и выращивание

культур в течение 32-48 ч (в зависимости от индивидуальных особенностей микроорга низма) при температуре 30-35°С (в зависи- 30 мости от термофил ьности культуры), при периодической продувке стерильным воздухом с целью аэрирования, уборку камеры, обработку ее формалином, аммиаком, паром.35

Основным недостатком такого способа является недостаточно высокий выход продукта.

Целью изобретения является повышение выхода биомассы.40

Это достигается тем, что в способе, предусматривающем стерилизацию увлажненных пшеничных отрубей, инокуляцию их посевным материалом, перемешивание, раскладывание полученной смеси в кюветы 45 и выращивание, в качестве посевного материала используют грибы рода Rhlzopus, а в процессе выращивания периодически через каждые 20-22 ч наслаивают свежие увлажненные пшеничные отруби толщиной в 1,5- 50 2,0 см до достижения конечной толщины слоев 7-8 см и процесс выращивания ведут в течение 120-124 ч.

Способ заключается в следующем.

Кюветы для поверхностного выращива- 55 ния микроорганизмов размером 40x75 см с высотой бортов 12 см и отверстиями для аэрирования культуры моют, обрабатывают формалином, аммиаком и паром. Пшеничные отруби увлажняют до 58-65 %, стерилизуют в течение 1-1,5 ч при 0,15 МПа. охлаждают и при температуре 40-45°С вносят посевной материал (например, культуры микромицетов Rhlzopus pygmaues pi-e и Rhizopus oryzae 1384-262 на пшеничных отрубях с содержанием спор не менее 0,7 млрд. на 1 г) в количестве 1-2% к объему питательной среды. Смесь тщательно и быстро перемешивают, при этом конечная температура смеси должна быть 30-32°С. Полученную смесь раскладывают в кюветы слоем 2-2,5 см. При использовании более тонкого слоя происходит быстрое подсыха- ниетвердофазной питательной среды, а при толщине слоя более 2,5 см наблюдаются недостаточно равномерное прорастание спор в процессе роста, снижение аэрации культуры.

Проращивание культуры ведут при температуре 30-32РС (наиболее характерные условия для микромицетов) в течение 20-22 ч. Время проращивания 20-22 ч характеризуется особым физиологическим состоянием культуры. К этому времени она находится в экспоненциальной фазе развития, которая характеризуется высокой скоростью размножения и началом формирования комплекса экзогенных ферментов, которые являются целевыми продуктами. Время менее 20 ч недостаточно для вызревания, достижения наибольшей скорости размножения и развития продуцентов.

Время выращивания более 22 ч приводит к резкому снижению скорости размножения клеток на фоне роста их биохимической активности.

Через 20-22 ч проращивания на твердую поверхность среды наслаивают новый питательный слой - отстерилизованные увлажненные пшеничные отруби высотой 1,5- 2,0 см, поддерживая температуру культивирования постоянной (30-32°С). Операцию аналогично повторяют несколько раз до достижения общей высоты питательного слоя 7-8 см. Использование высоты питательного слоя менее 743 см не вполне отвечает поставленной цели из-за экономических соображений, а высота слоя более см нежелательна в связи с превалированием старения культуры, снижением ее аэрации, значительным накоплением продуктов биохимической деятельности продуцентов.

Рекомендуемая общая продолжительность выращивания 120-124 ч установлена экспериментально и связана также с изменением физиологической активности культуры и снижением возможности к аэрации. При меньшей продолжиюльности оыращи- аания при использопянии нлол..-инлиия невозможно достичь нужной высоты слоя, а следовательно, значительно повысить выход продукта с единицы рабочей поверхности. При этом культура не имеет нужного уровня активности ферментов. Время выращивания более 124 ч нецелесообразно в связи со старением культуры и снижением выхода активной биомассы.

Пример 1. 1 кг пшеничных отрубей среднего помола с крахмалистостью 18 % увлажняют водопроводной водой до конечной влажности 63%, стерилизуют в автоклаве при 0,15 МПа в течение 1 ч. Подготовленные отруби охлаждают до 40- 45°С, инокулируют посевным материалом мицелиальных грибов Rhlzopus (2% к массе увлажненных отрубей с содержанием спор 0,7 млрд на 1 г), тщательно перемешивают и раскладывают в кюветы (размером 20x40x12 см) высотой 2 см. Накрывают крышкой и ведут выращивание в течение 20 ч при 30°С. Затем наслаивают на проросшую в питательной среде новую партию аналогично подготовленных отрубей высотой 1,5 см, поддерживая температуру постоянной (30°С). Операцию повторяют через 40, 60 и 80 ч от начала выращивания. Культивирование продолжают до достижения общей продолжительности 120ч, затем поверхностную культуру на пшеничных отрубях извлекают из кюветы и определяют качество биомассы по уровню глюкоамилаз- ной (ГлА) и протеолитической (ПА) активности, а кювету обрабатывают.

Пример 2. 1 кг пшеничных отрубей среднего помола, крахмалистостью 18 % увлажняют водопроводной водой до конечной влажности 63%, стерилизуют в автоклаве приО,15 МПа втечение 1 ч. Отстерилизован- ные отруби охлаждают и вносят посевной материал. Смесь тщательно перемешивают и раскладывают в кюветы высотой слоя 2,5 см. Накрывают крышкой и ведут выращивание 20 ч. Затем новый питательный слой 1,5 см наслаивают на проросшую культуру. Операцию повторяют через 40, 60.80 ч (при общей продолжительности культивирова-- ния 120 ч. Затем культуру извлекают, определяют качество биомассы и используют по назначению. Кюветы обрабатывают.

Пример 3. Пшеничные отруби предварительно готовят аналогично примерам 1, 2, раскладывают в кюветы высотой слоя 3,0 см. Накрывают крышкой и ведут выращивание в течение 20 ч. Операцию повторяют через 40, 60, 80 ч от начала выращивания, наслаивая сверху пшеничные отруби высотой 1,5 см. По истечении общего времени выращивания 120ч культуру снимают, определяют качество биомассы и используют, а кюветы обрабатывают.

Пример 4. Пшеничные отруби (по примерам 1, 2) раскладывают в кюветы вы- 5 сотой слоя 2,2 см. Проращивание ведут в течение 21 ч, а затем операцию повторяют через 42, 63, 84 ч от начала выращивания. выдерживая каждый раз высоту слоя 1.3 см. По истечении 124 ч от начала процесса куль- 10 туру снимают, определяют качество биомассы и используют. 4,

Пример 5. Инокулированные пшеничные отруби (по примерам 1,2) раскладывают в кюветы высотой слоя 2 см и проращивают

5 в течение 22 ч. Операцию повторяют через 44,66 и 88 ч при высоте каждого слоя 1,5 см и после последнего наслаивания ведут до- ращивание до общей продолжительности 128 ч, затем поверхностную культуру извле0 кают из кюветы, определяют активность биомассы и используют.

Пример 6. Инокулированные пшеничные отруби (по примерам 1,2) раскладывают в кюветы высотой слоя 2 см и проращивают

5 в течение 22 ч. Операцию повторяют через 44, 66 и 88 ч при высоте каждого слоя 1 см. Затем культуру доращивают до общей продолжительности процесса 124 ч. Далее поступают, как в вышеприведенных примерах.

0 Экспериментальные данные по примерам 1-6 приведены в табл. 1. Опытные данные приведены для Rhlzopus pygmaues pi-e - продуцента глюкоамилазы и протеолити- ческих ферментов. Аналогичная эависи5 мость,отмечена и для Rhizopus oryzae 1362-284.

Предлагаемое техническое решение имеет следующие преимущества по сравнению с прототипом:

0 снижение трудоемкости за счет снятия операций по обработке кювет, подготовке посевного материала и ручного труда по раскладыванию инокулированной питательной среды. Для получения одного и того

5 же количества культуры по прототипу при рекомендуемой высоте слоя 2-2,5 см произ водственный цикл необходимо повторить 3- 4 раза со всеми операциями по подготовке кювет, помещений, посевного материала,

0 основного выращивания;

экономия посевного материала в 4-5 раза, так как для осуществления способа по прототипу каждый производственный цикл потребует расход посевного материала 1-2

5 % к массе увлажненных отрубей, по предлагаемому техническому решению посевной материал используется один раз лишь на первой стадии;

увеличение выхода готового продукта (поверхностной культуры) в 2,5-3,0 раза с

единицы растильной площади при практически одинаковом уровне биохимической активности мицелиальных грибов.

(56) Жеребцов Н. А.. Щеблыкина Л. В. Культивирование плесневого гриба Rhlzopus pygmaues pi-e на твердых питательных средах. Микробиологическая промьшлен- Общая сравнительная характери- 5 ность, -1972, вып. 2, с. 31.

Грачева И. М. Технология ферментных препаратов. М.: ВО Агропромиздат, 1987.

стика обоих способов представлена в табл.2.

4

10

Таблица

Показатели

Формула изобретения

СПОСОБ ТВЕРДОФАЗНОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИЦЕЛИАЛЬНЫХ ГРИБОВ, предусматривающий стерилизацию увлажненных пшеничных отрубей, .инокуляцию jix посевным материалом, перемешивание, аскладывание полученной смеси в кюве- ы и выращивание, отличающийся тем, что,

Т а 6л ица 2

Значение показателей

по прототипу

по предлагаемому техническому решению

бработка формалином, аммиаком, па- ,Т5МПа в течение 1 ч, W-58-68% -2% к массе отрубей

36-42

Вручную

Вручную

,15 МПа в течение 1

4,W-58-68%

2% к массе отрубей

36-42

2-2,5

1,8-1,5

.

17-17,6 20-19

Обработка формалином, аммиаком, паром 0,15 МПа в течение 1 ч, W-58-68%

1-2% к массе отрубей 20-22

0,15 МПа в течение 1 4,W-58-68%

2Q-22t

7-8

6,0-6.3

17,6-18.2 20-19

с целью повышения выхода биомассы, в качестве посевного материала используют грибы рода Rnlzopus, в процессе выращивания периодически через каждые 20 - 22 ч наслаивают свежие увлажненные пшеничные отруби толщиной - 2 см до достижения конечной толщины слоев.7 - 8 см и процесс выращивания ведут в течение 120 -124ч.