Способ приготовления посевного материала для культивирования плесневых грибов вида aSpeRGILLUS аUтамоRI,продуцирующих глюкоамилазу (его варианты) Советский патент 1983 года по МПК C12N9/14 C12N9/34 

ления посевного материала для культивирования плесневых грибов вида Aspergillus awamori, продуцирующих глюкоамилазу, предусматривающему посев продуцента на увлажненную питательную среду, содержащую источник углерода, солодовые ростки и необходимые минеральные соли, выращивание продуцента до обильного спороношения и последующее культивирование на производственной питательной среде, в качестве источника углерода в твердых питательных средах используют 50-90% пшеничных отрубей и ЦО3Q% муки: кукурузной илиячменной, или рисовой, или ржаной, или маниоки или соевой, а процесс выращивания продуцента ведут в две стадии при различном температурном режиме, поддерживая его на первой стадии в течение 5-6 дней равным 29-31° С, а по до. стижении обильного спороношения температуру снижают до 20-24 с и осущест вляют вторую стадию также в течение 5-6 сут с последующей селекцией полученных на этой среде конидий в несколько пассажей, при этом в качестве производственной среды используют высококонцентрированное по углероду зерновое сусло с концентрацией 15-25°Б. При этом при выращивании штамма Asp. awamori 466 селекцию ведут в дв пассажа при повышении активности от 100 ед ГлА/г сухой культуры на стадии выращивания до 300 ед ГлА/г сухой культуры после второго пассажа Кроме того, увлажнение питательны сред осуществляют раствором следующих солей, вес.%: NaNOj, 0, (МН4)НР04 0,2-0,3; КН2.Р04 0,22-0,23 КС1 0,11-0,12; MgS04 0,103-0,104; FeS04 0,011-0,015; MnS04 0,05-0,06; CoS04 0,004-0,005; Zn $04 0,0010,002; CuS04 0,004-0,005; вода - остальное. Способ приготовления посевногй ма териала ддя культивирования плесневы грибов вида Asp. awamori, продуцирующих глюкоамилазу, предусматривающий посев продуцента на питательную среду, содержащую источник углерода, выращивание продуцента до обильного спороношения и последующее культивирование на производственной питатель ной среде, посев продуцента осуществляют на среду, содержащую растворимый крахмал , агар-агар 1-2%, и ячменное сусло 7-8%, а процесс выращивания ведут в две стадии при различном температурном режиме, поддерживая его на первой стадии в течение 56 дней равным 29-31 С, а по достижении

обильного спороношения температуру снижают до и осуществляют вторую стадию в течение 5-6 сут, при этом в качестве производственной питательной среды используют высококонцентрированное по углероду зерновое сусло с концентрацией 15-25 5.

Засев посевного материала в производственную питательную среду осуществляют в количества 0,001250,005 к объему питательной среды.

Предлагаемь1Й способ осуществляют следующим образом.

Готовят концентрированную по крахмалу твердую питательную среду, содержащую от 50 до 90 пшеничных отрубей с соответствующей добавкой солодовых ростков или от 40 до 90% маниОки, или ржаной, или ячменной, или рисовой, или кукурузной или соевой муки с соответствующей добавкой солодовых ростков. Увлажняют твердую среду до 60% влажности или просто водопроводной водой Или раствором солей слёду10щего состава, вес,%: НаНО- Q ,Э, (NH4)2HP04 0,2; 0,22; КС1.0,11 MgS04 0,103; FeS04 0,011; N0804.0,005 CoS04 0,004; ZnS04 0,001; CuS040,001 вода - остальное. Культуру выращивают 5-6 дней при 29-31 С, а затем температуру снижаЮт до 20-24 С и осуществляют вторую стадию выращивания также 5-6 дней. После этого осуществляют селекцию культуры на этой же среде при тех же параметрах и времени. Получают 1 и II пассажи культуры. Готовые пассажи засевают на зерновое сусло, содержащее . Посев продуцента можно осуществлять на среду, содержащую растворимый крахмал от 2 до 15%, агар-агар 1-2% и ячменное , сусло 7-8%, а затем готовые пассажи засевают на зерновое сусло, содержащее 15-25 Б. Активность посевного материала с применением концентрированных по крахмалу сред варьирует от 100 до 210 ед/г сухой культуры, а количество спор от 2,2 до 4,2 млрд, конидий на 1 г сухой культуры-. Причем наблюдается корреляция активации культур с увеличением дозировки крахмала и полное отсутствие корреляции в отношении спорообразования. в связи с этим для увеличения спорообразования, а также активации конидиального материала, с целью уменьшения расхода культур, можно добавлять растворы солей при увлажнении тверды питательных сред. При готовленный посевной материал засевают в производственную среду в ко личестве 0,00125-0,005. Дозировку полученного активированного конидиального посевного материала на высококонцентрированные среды необходимо проводить с учетом конкурентной борьбы за субстрат (т.е. концен трации среды по углероду) и с учетом природы атакуемости субстрата (различные по крахмалу субстраты) , например, для различных штаммов Asp awamori в диапазоне от 25 до 100 тыс конидий на 1 мл среды (18-20 Бал к .курузного сусла) и от 800 тыс. до 1 млн. конидий на 1 мл среды (1820 Бал пшеничного, ячменного, рисового, соевого, ржаного сусла). При соблюдении рекомендуемых условий выращивания и дозировки посевного конидиального материала активность глюкоамилазы в культуральной жидкости на 6-7 сут роста составляет 300 350 ед/мл культуральной жидкости для 1 пассажа ед/мл культуральной жидкости, для второго пассажа 500-600 ед/мл культуральной жидкости. П р и м е р 1. Питательную среду состоящую из 50% пшеничных отрубей и 501 солодовых ростков, увлажняют до 60 водопроводной водой, засевают культурой гриба Asp. awamori 66 выращенной на агаризованной среде сл дующего состава, %: сахароза 2, азот нокислый натрий (НаНОз) 0,9Г, однозамещенный фосфорнокислый калии () 6,1, магний сернокислый (MgSO) 0,05; хлористый калий ,(КС) 0,05; сернокислое железо (FeSO 0,001 , агар-агар 2 (при 22С в течение 14 дней). Засеянную культуру выращивают 6 дней при в термостате, а затем выращивают при 2СР С также 6 дней. По сле выращивания осуществляют селекц культуры на этой же среде при тех же параметрах температуры и времени. И получают 1 и П пассажи культуры пере севом выращенной культуры на 1 пасса и 1 пассажа на II пассаж. АКТИВНОСТЬ глюкоамилазы готовых посевных культур составляет 115 ед/г 76 сухой культуры, 220 ед/г сухой культуры Т пассажа, 250 ед/г сухой культуры II пассажа. Ззтем готовую культуру засевают в количестве 70-90 тыс. конидий на 1 мл питательной среды на 18Бал кукурузное сусло. После 7 сут культивирования активность глюкоамилазы в культуральной жидкости составляет для пассажа 350 ед/мл; 1 пассажа 410 ед/мл, Ш пассажа 550 ед/мл. П р и м е р 2. Питательную среду, состоящую из 50% кукурузной муки и 50% солодовых ростков, приготовляют, выращивагоу и рассевают на пассажи 1 и f так же, как в примере 1. Полученный конидиальный споровый материал с активностью 250 ед/г сухой культуры засевают 60-80 тыс. конидий на 1 мл питательной среды на кукурузное сусло. После 7 сут культивирования получают культуральную жидкость с активностью глюкоамилазы: 1 пассажа lOO ед/мл, . II пассажа бОО ед/мл. Примерз. Приготовляют на косом агаре культуру Asp. awamori на среде, содержащей,вес. %: растворисодержащеи вес. могр крахмала lOi 8 Бал ячменное сусло, агар-агар 2. Культуру выращивают при тех же условиях температуры и вре мени, что и в примере 1. Затем полученную культуру засевают в количестве 90 тыс. конидий на 1 мл питательной среды на кукурузном сусле. После 7 сут культивирования активность глюкоамилазь на 18 Бал кукурузном сусле составляет 350 ед/мл, на кукурузном сусле - QQ ед/мл (для 2% концентрации растворимого крахмала в среде) и tOO ед/мл для 18 Бал кукурузного сусла 10 растворимого крахмала на косом агаре), 500 ед/мл для кукурузного сусла (10% растворимого крахмала на косом агаре). П р и м е р 4. Твердую питательную среду того же состава, что в примере 1, увлажняют до 60% солевым раствором состава, вес.%: азотнокислый натрий (NaNOj) 0,9; двузамеи4енный фос.форнокислый аммоний (Н)РО 0,2, однозамещенный фосфорнокислый калий KHjjO 0,22, хлористый калий КСi 0,11, сернокислый, магний MgSO 0,103 сернокислое железо закисное : 0,011 сернокислый марганец MnS040,005, сернокислый кобальт CoS04 ,004, сернокислый цинк .OOl сернокислая медь CuSO 0,00, вода остальное, Получают конидиальный материал с активностью 150 ед ГлА/г сухой культуры. Затем его высевают в количестве 78 тыс..конидий на 1 мл питательной среды кукурузного сусла. На 7 сут роста получают культуральную жидкость с активностью kOQ ед ГлА/мл культуральной жидкости П р -и м е р 5. Питательную сре-г ду, состоящую из 70 ржаной муки, 30 солодовых ростков, увлажняют до 60% водопроводной водой, выращивают и рассевают на пассажи так же, как и в примере 1. Полученный посев ной материал с активностью 205 ед/г сухой культуры засевают в количестве 850 тыс, кс{иидий на 1 мл питатель ной среды на 18 Бал кукурузное сусло. После 7 сут культивирования получают культуральную жидкость с активностью ГлА для I пассажа ЗООед/мл II - 350 ед/мл; 111 - lOO ед/мл. П р и м е р 6. Питательную среду, состоящую из 70% ячменной муки И 30%солодовых ростков, увлажняют и рассевают так же, как в примере 1. Полученный посевной материал с активностью 200 ед/г сухой культуры засевают в количестве 900 тыс. кони дий на 1 мл питательной среды на ку курузное сусло . После сут культивирования получают активность глюкоамилазы (ГлА) для: 1 пассажа 350 ед/мл, П - 400 ед/мл, Ш - 30 ед/мл П р им ер 7« Питательную среду состоящую из 50% рисовой муки и 50% солодовых ростков, приготовляют, выращивание и рассев производят так же, как в примере 1. Полученный конидиальный материал с активностью 210 ед/г сухой культуры засевают в количестве 830 тыс. конидий на 1 мл питательной среды на 19Бал кукурузное сусло. После 7 сут культивирования получают культуральную жидкость с активностью ГлА для: 1 пассажа 330 ед/мл; для 11 - too ед/мл, для III - 500 ед/мл. П р и м е р-8. Питательную среду,, состоящую из 50% маниоки и 50% солодовых ростков, приготовляют вырашивание и рассев производят так же, как и в примере Ь Полученный посевной материал с активностью ГлА 200 ед/г сухой культуры засевают в количесдве 900 тыс. конидий на 1 мл питатель ной среды на 18°Бал кукурузное сусло. После 7 сут культивирования по7.8 лучают культуральную жидкость с активностью ГлА для 1 пассажа 320 ед/мл, для II - 370 ед/мл; для М - 50 ед/мл. П р и м е р 9. Питательную среду, состоящую из 50% пшеничных отрубей и 50% солодовых ростков, засевают штаммом гриба Asp. awamori и рассевают так же, как в примере 1. Полученный посевной материал с активностью 100 ед/г сухой культуры засевают в количестве 50 тыс конидий на 1 мл питательной среды 18Бал кукурузное сусло.,После 7 сут культивирования получают культуральную жидкость с активност1зю ГлА для: 1 пассажа 80 ед/мл, для П - 150 ед/млJ для 111 - 200 ед/мл. Согласно изобретению, получают спороносящую культуру от (2-)10 спор в 1 г воздушно-сухой культуры, но более активизированную, которая при дальнейшем культивировании в глубинных условиях на высококонцентрированны углеводных средах позволяет увеличить биосинтез глюкоамилазы в 2-3 раза по сравнению с контролем (вегетативной культурой). Кроме того, упрощается технологическая схема подготовки посевного материала: исключается посев в маточники, обеспечивается микробиологическая стерильность процесса, сокраща- . ется на 1 ,5-2 сут время приготовления посевного материала, активность новых конидиальных культур при хранеНИИ 20-25 0 не уменьшается в течение 1-1,5 лет, а для I и II пассажей повышается по сравнению с контролем, т.е. хранением культуры на косом агаре, уменьшается расход конидиального посевного материала по сравнению с принятым ранее в 100 раз, а по сравнению с вегетативным в 200 раз. Формула изобретения 1. Способ приготовления посевного материала для культивирования плесневых грибов вида Aspergillus awamori, продуцирующих глюкоамилазу, предусматривающий посев продуцента на увлажненную питательную среду, содержащую источник углерода, солодовые ростки и необходимые минеральные соли, выращивание продуцента до обильного спороношения и последующее культивирование на производственной питательной среде, о т л и ч аю щ и и с я теи, что с целью повышения активности посевного материала путем адаптации его к высококонцентрированным производственным углеводным питательным средам и сокращения расхода посевного материала, в качестве источника.углерода в твёрдых питательных средах используют 5090 пшеничных отрубей и tQ-ЭQ% муки: кукурузной или ячменной, или рисовой, или ржаной, или маниоки, или соевой, а процесс выращивания продуцента ведут в две стадии при различном температурном режиме, поддерживая его на первой стадии в течение дней равным 29-31С, а по достижении обильного спороношения температуру. снижают до 20-2i ® С и осуществляют вторую стадию в течение 5-6 сут с последующей селекцией полученных на этой среде конидий в несколько пассажей, при этом в качестве производственной питательной среды используют высококонцентрированное по углероду зерновое сусло с концентрацией 15-25 Б.

2,Способ по п. 1, отличающийся тем, что при выращивании в качестве продуцента штамма Aspergillus awamori 466 селекцию ведут в два пассажа при повышении активности от 100 ед ГлА/г сухой культуры на стадии выращивания до

300 ед ГлА/г сухой культуры после второго пассажа,

3,Способ по пп, 1 и , отличающийся тем, что увлажнение питательных сред осуществляют раствором следующих солей, вес.%: ,9-lj (NH4)zHP04 0.2-0,3; КНарОд 0,22-0,23; КС1 0,11-0,12; MgS04. 0,103-0,104; FeS04. 0,011-0,015, MnSO.. 0,05-0,06; CoS040,,005j

ZnS04. 0,001-0,002; CuSO 0,0040,005, эода - остальное,

4t Способ приготовления посевного материала для культивирования

плесневых грибов Aspergillus awamori, продуцирующих гшжоамилазу, предусматривахмций посев продуцента на питательную среду, содержащую источник углерода, выращивание продуцента до обильного спороношения и последующее культивирование на производственной питательной среде, отличающийся тем, что, с целью активации посевного материала путем адаптации его к высококонцентрированым по углероду питательным средам, посев продуцента осу.ществляют на питательную среду, со- , держащую 2-15% растворимого крахйала, 1-2% агар-агара и 7-8 ячменного сусла, а процесс выращивания ведут в две стадии при различном темпер турном режиме, поддерживая его .на первой стадии в течение 5-6 дней

равным 29-31С, а по достижении обильного спороношения температуру снижают до 20-24с и осуществляют вторую стадию в течение 5-6 сут, при этом в качестве производственной питательной среды используют высококонцентрированное по углероду зерновое сусло с концентрацией 15-25 Б,

5. Спосс по пп. 1-4, отличающийся тем, что засев посевного материала в производственную питательную среду осуществляют в количестве 0,00125-0,005% к объему питательной среды

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1.Грачева И.М. Технология фер-. ментных препа затов. Н., 1979, с, б7-б9.

2.Авторское свидетельство СССР № 668941, кл. С 12 N 9/34, 1977 (прототип),