Способ очистки микробной эстеразы Советский патент 1993 года по МПК C12N9/18 C12N9/18 C12R1/125 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способу очистки эстеразы из Bacillus subtilis. которая может быть использована в химической, медицинской и микробиологической промышленности.

Известно несколько способов выделения и очистки эстеразы Bacillus subtilis 1,2,3.

По способу 1 для получения гомогенного препарата экстракт фермента из клеток подвергают дробному осаждению сульфатом аммония, а затем очистке методом хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе, ДЭАЭ-сефадексе, прогреванию в различных условиях, препаративному электрофорезу. Выход по активности указывается авторами лишь на промежуточных стадиях и составляет после ДЭАЭ-сефадекса 39% при степени очистки 16 раз, Многостадий- ность схемы очистки является недостатком данного аналога.

В способе 2 фермент был очищен в 400 раз с использованием осаждения солями MnCl2, прогреванием, хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе и гель-хроматографией на P-150, выход составил 59%, однако полученный фермент не гомогенный, что является серьезным недостатком данного аналога.

Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому решению, который выбран авторами в качестве прототипа, является способ 3. По данному способу грубый экстракт клеток Bacillus subtilis ДС-1 (PERM BP-1254) подвергают дробному осаждению сульфатом аммония, диализу, ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-се- фарозе CL-6B, гель-хроматографии на Се- факриле S-200 и Сефадексе G-150 и ионообменной хроматографии на QAE-ce- фадексе. Гомогенность эстеразы подтверждена методом электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) в присутствии додецилсульфата натрия (SDS).

Недостатками данного технического решения является то, что для получения гомогенной эстеразы необходимо провести 5 стадий очистки, в результате чего выход фермента составляет лишь 9,9%,

Целью изобретения является упрощение технологии и повышение выхода конечного продукта.

Поставленная цель достигается тем, что для получения гомогенного препарата используется культура Bacillus subtilis ЦМПМ В-3236. После осаждения эстеразы из грубого экстракта сульфатом аммония без предварительного обессоливания ферментный раствор сорбируют на гидрофобном сорбенте в фосфатном буфере, содержащем

сульфат аммония 40-35% насыщения, десорбцию эстеразы проводят после элюции балластных белков в фосфатном буфере в градиенте концентрации сульфата аммония

от 20-15% до 0, доочистку эстеразы проводят на Сефакриле S-200.

Авторами было найдено, что возможность существенного упрощения технологии достигается за счет улучшенной

сорбции фермента при гидрофобной хроматографии по сравнению с ионообменной, это свойство фермента ранее в литературе не описано. В результате появилась возможность ограничиться одностадийной очисткой. Существенным является выбор экспериментально обоснованных условий проведения хроматографии на гидрофобном сорбенте, рН сорбции подбирают для конкретного сорбента.

Только совокупность взаимосвязанных и взаимозависимых признаков обеспечивает положительный эффект, заключающийся в эффективном способе получения гомогенной микробной эстеразы.

П р и м е р 1. .40 мл грубого экстракта клеток Bacillus subtilis ЦМПМ В-3236 с удельной активностью эстеразы ( активность эстеразы определяется колориметрически, субстратом является

индофенилацетат) 4,0 ед/мг белка подвергают дробному осаждению сульфатом аммония 20% (4,4 г с.а./40 мл) - 80% (16,8 г с.а./40 мл) от насыщения. Полученный осадок растворяют в 20 мл 0,02 М фосфатном

буфере рН 7,5, содержащем сульфат аммония 40% насыщения и наносят на колонку объемом 55 мл с гидрофобным сорбентом Butyl-TSK 650, уравновешенным тем же буфером, Элюцию балластных белков проводят 0,02 М фосфатным буфером с сульфатом аммония с 20% насыщения рН 7,5, Фермент десорбируют градиентом сульфата аммония 20% до 0 в 0,02 М фосфатном буфере, со скоростью элюции 16 мл.ч/см2, собирают

фракции объемом 5,5 мл. Объединяют фракции, содержащие зстеразную активность, получают 30 мл раствора фермента. Этот раствор наносят на колонку объемом 800 мл с сефакрилом S-200, уравновешенным 0,1 М

фосфатным буфером рН 7,1. Фракции, со- держащие эстеразу, объединяют, В результате очистки получили 60 мл раствора зстеразы с удельной активностью 400 ед/мг белка и общим выходом 60%. Для хранения

раствор лиофилизируют,

Пример 2-5 выполняют аналогично примеру 1, меняя условия сорбции на сорбенте Butyl-TSK, условия проведения и полученные результаты приведены в табл.1.

Пример 6. 40 мл грубого экстракта клеток Bacillus subtllls B-3236 с удельной активностью эстеразы 4,5 ед/мг белка подвергают дробному осаждению сульфатом аммония 20%-80% от насыщения. Полученный осадок растворяют в 20 мл 0,02 М фосфатного буфера рН 5,3, содержащего сульфат аммония 40% насыщения, и наносят на колонку объемом 55 мл с гидрофоб- ным сорбентом Солоза КГ 20/30, уравновешенным тем же буфером. Элюцию балластных белков проводят 0,02 М фосфатным буфером с сульфатом аммония 20% насыщения рН 5,3. Фермент десорбируют градиентом сульфата аммония 20% до 0 в 0,02 М фосфатном буфере. Остальные операции проводят аналогично примеру 1. В результате очистки получили 60 мл раствора эстеразы с удельной активностью 320 ед/мг белка с общим выходом 56%.

Пример 7-9. Выполняют аналогично примеру 6, меняя условия десорбции эстеразы на сорбенте Солоза КГ 20/30, данные приведены в табл.1.

Пример 10, Выполняется аналогично примеру 1 на сорбенте Солоза КГ 8/24, условия проведения и полученные результаты приведены в табл.1.

Из табл.1 следует, что наилучшие результаты по сорбции эстеразы на гидрофобном сорбенте получают при содержании в ф фатном буфере сульфата аммония от 40- ЗБ/о от насыщения. Десорбцию следует

проводить в фосфатном буфере в градиенте концентрации сульфата аммония от 20-15% ДоО.

В табл.2 приведены данные о степени очистки и выхода продукта на каждой стадии при минимальном значении удельной активности грубого экстракта.

Гомогенность эстеразы показана методом электрофореза в ПААГ в присутствии

0 додецилсульфата натрия. Основные параметры, характеризующие очистку по предлагаемому способу в сравнении с прототипом, представлены в табл.3.

Таким образом, по предлагаемому спо5 собу в сравнении с прототипом в 5,6-6,0 раз увеличивается выход конечного продукта, сокращается количество стадий очистки при условии получения гомогенного фермента с 5доЗ.

0 Кроме того, использование гидрофобных сорбентов вместо ионообменных после осаждения белка сульфатов аммония не требует проведения предварительного обессо- ливания,

5 (56) LHigeralT.B., Splzizen J. Isolation of two acetyt esterase from extract of Вас.subtllls.I. of bacterial, 1973-114, p.1184-1192.

2.Rifler O.F., Higeral T.B. Characterisation of Intracellular esterase A from 0 Bacillus subtllls, BBA-1976-429, р.19Ы97.

3.EP№ 0243167, кл. С 12 N9/18, 1987.

Таблица 1

Таблица 2

Сущноаь изобретения: после осаждения эс- теразы из грубого экстракта сульфатом аммония без предварительного обессоливания ферментный раствор сорбируют на гидрофобном сорбенте в фосфатном буфере, содержащем (NH ) SO 40 - 35% насыщения десорбцию эстеразы проводят после элюции балластных белков в том же буфере в градиенте концентрации (NH ) SO от 20-15% до 0 с последующей доочисткои на сефакриле S - 200. 3 табд

Формула изобретения ;

СПОСОБ ОЧИСТКИ МИКРОБНОЙ ЭС- ТЕРАЗЫ, предусматривающий дробное осаждение фермента сульфатом аммония из грубого экстракта клеток Bacillus subtills и хроматографию с использованием сефакрил S-200, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа и повышения выхода целевого продукта, фермент

Таблица 3

осаждают из грубого экстракта клеток ; Bacillus subtilis ЦМПМ В-3236, сорбцию осуществляют на гидрофобном сорбенте в фосфатном буфере, содержащем сульфат аммония 40 - 35%-ного насыщения, десорбцию эстеразы проводят в фосфатном буфере в градиенте концентрации сульфата аммония от 20 - 15 до 0% с последующей доочисткой на афакриле S - 200.