Способ выделения НАД-зависимой формиатдегидрогеназы Советский патент 1989 года по МПК C12N9/02 

Изобретение относится к биохимии и касается способа выделения и очистки НАД-зависимой формиатдегидрогеназы (КФ 1.2.1.2.), которая является базовым ферментом для создания на ее основе систем регенерации кофактора (ПАДИ), которые в свою очередь могут быть использованы в тонком органическом синтезе, биохимическом анализе, медицинской диагностике.

Цель изобретения - увеличение удельной активности препарата и упрощение процесса.

Способ осуществляют следующим образом.

Экстракт, приготовленный разрушением клеточной суспензии в ультразвуковом дезинтеграторе или разрушением замороженных клеток на Х-прессе или другим соответствующим способом, осаждают 40%-ным сульфатом аммония, а супернатант подвергают гидрофобной хроматографии, используя в качестве сорбента носители, содержащие в качестве заместителей октипьную группировку (октил-сефароза, октил-сило(

Ю

хром, октин-агароза) в условиях нисходящего градиента ионной силы элюи- рующего буфера. Удельная актипность полученного препарата составляет 11 мкмоль/мин.мг, что позволяет использовать его в практике. Основными примесными компонентами после стадии гидрофобной хроматографии являются низкомолекулярные пигменты и два бел- ка с молекулярными массами около 150 и 10-25 кДа соответственно. Для достижения большей степени очистки целесообразно дополнительно провести очистку методом, позволяющим разделить белки по молекулярной массе, например, последовательным пропусканием препарата через мембраны (полые волокна) с отсекающей молекулярной массой около 100 и 30 кДа соответствен- но или гель-фильтрацией на носителях, позволяющих осуществлять фракционирование белков в диапазоне молекулярных масс 20-200 кДа (например, Тойоперл HW55 (Тойо-Сода, Япония), Сефакрил S-200, Сефадекс G-200 (Фармация, Швеция), ультрагель АсА-44 (LKB, Швеция)) Все стадии выделения и очистки проводят в присутствии 0,01 М ЭДТА в качестве стабилизатора ферментативной активности. После очистки гель-проникающей хроматографией получают препарат фермента с выходом 40% и удельной активностью 15 мкмоль/мин-мг.

Пример 1. 50 г клеток Fseu- domonas sp.101 суспендируютчв 50 мл 0,1 М калий-фосфатного буфера, 0,01М ЭДТА, рН 7,8. Разрушение проводят на ультразвуковом дезинтеграторе УЗДН в положении максимального резонанса (частота 20 кГц, мощность 0,3 Вт) в течение 20 мин при охлаждении. Температура клеточной суспензии не должна превышать 15 . Охлаждение наружное (ванна со льдом и солью). Активность

фермента после разрушения 6000 мкмоль/ /мин. Удельная активность 0,6 мкмоль/ /мин миг,

К разрушенной клеточной суспензии добавляют при необходимости препарат ДНК-азы для разрушения нуклеиновых кислот, увеличивающих вязкость суспензии, и оставляют на 30 мин.

Клеточную суспензию центрифугируют 60 мин при охлаждении при 15000g для удаления крупных клеточных и субклеточных частиц. Активность фермента 5500 мкмоль/мин. Удельная активность 0,6 мкмоль/мин-мг.

Q 5 0

5

5

0

5

К гомогенлту порциями при постоянном перемешивании добавляют насыщенный раствор сульфата аммония в 0,05 М калий-фосфатном буфере, 0,01 М ЭДТА, рН 7,8 до конечной концентрации сульфата, равной 40%,

Через 12 ч раствор центрифугируют 30 мин при охлаждении при 15000g. Осадок отбрасывают. Активность фермента 4900 мкмоль/мин. Удельная активность 0,7 мкмоль/мин-мг.

Свежий или регенерированный носитель (октил-сефароза CL-4B, Фармация, Швеция) помещают в колонку 50х 100 мм объемом около 200 мл и уравновешивают его 0,03 М калий-ф осфатным буфером, 0,01 М ЭДТА, 30% сульфат аммония, рН 7,8. Раствор фермента наносят на колонку со скоростью от 2 до 10 мл/см2-ч и промывают исходным буфером. После элюции белков, не сорбирующихся на гидрофобном носителе, формиатдегидрогенаэу элюируют линейными нисходящим градиентом 30%-ного сульфата аммония в И,03 М калий-фосфатном буфере, 0,01 М ЭДТА, рН 7,8, суммарным объемом 500 мл. Объединяют фракции фермента с удельной активностью от 9 до 11. Фракции с удельной активностью от 5 до 9 могут быть использованы при очистке гидрофобной хроматографией следующей партии фермента. Активность фермента 2900 мкмоль/мин. Удельная активность 10 мкмоль/мин-мг.

Пример 2. Способ осуществляют согласно примеру 1, но после стадии гидрофобной хроматографии объединенные фракции фермента концентрируют до объема 25 мл ультрафильтрацией, используя мембраны или полые волокна с отсекающей молекулярной массой 10 кДа. Раствор фермента наносят на колонку объемом 1,5 л (50 х 750 мм) с сефакрилом S-200, уравновешенным 0,05 М калий-фосфатным буфером, 0,01 М ЭДТА, рН 7,8. Скорость нанесения фор- миатдегидрогеназы до 2 мл/см2-ч. Фор- миатдегидрогеназа элюирует в объеме 800-1100 мл. Объединяют фракции с удельной активностью от 14 до 16. Фракции с удельной активностью от 9 до 14 могут быть использованы при очистке гель-проникаЕощей хроматографией следующей партии фермента. Активность фермента 2200 мкмоль/мин. Удельная активность 15 мкмоль/мин-мг. Выход 40%.

Примеры 1 n } шглюг рпруютгя таблицей.

Пример 5. Способ осуществляют согласно примеру 2, но дезинтеграцию проводят на Х-пресср. 50 г разморо- кенньгх клеток Pseudomonas sp.101 помещают в ячейку для разрушения, которую яаморажипают жидким азотом или смесью сухого льда с ацетоном. Разрушение производят постепенно повышая давление до-10 т/см2. Процедуру разрушения повторяют два раза. Удельная активность 15 мкмоль/миг-мг. Выход 35%.

П р и м е р А. Способ осуществляют согласно примеру 2, но дезинтеграцию проводят перетиранием клеток со стеклянными бусами. 50 г клеток суспендируют в минимальном объеме 0,1 М калий-фосфатного буфера, 0,01 М ЭДТА, рН 7,0 и добавляют равный объем стеклянных бус (шариков) диаметром 0,3- 0,5 мм. При 1700 об/мин время разрушения составляет 20 мин. Удельная активность 15 мкмоль/мин мг. Выход 35%.

Пример 5. Способ осуществляют согласно примеру 2, но на стадии гидрофобной хроматографии вместо октил- сефарозы используют октил-силохром. Колонку с. носителем (220 мл) уравновешивают 0,1 М калий-фосфатным буфером, 0,01 М ЭДТА, 40%-ным сульфатом аммония, рН 7,0. Препарат фермента промывают 2 л 0,1 М калий-фосфатного буфера, 0,01 М ЭДТА, 30%-ным сульфатом аммония, рН 7,0 и элюируют линейным нисходящим градиентом общим объемом 1000 мл 30%-ного сульфата аммония в 0,1 М калий-фосфатном буфере, 0,01 М ЭДТА, рН 7,0. Скорость элюции составляет до 10 мл/см2, ч. Объединяют фракции с удельной активностью более 9 мкмоль/мин-Mr. Удельная активность 13 мкмоль/мин-мг. Выход 35%.

Пример 6. Способ осуществляют согласно примеру 1, но вместо клеток Pseudomonas sp. 101 берут клетки Candida methylica. Общая активность фермента в бесклеточном экстракте после разрушения 50 г клеток составляет 1000 мкмоль/мин. Удельная активность собранных фракций после гидрофобной хроматографии - 8 мкмоль/мин-мг. Общая активность 500 мкмоль/мин. Выход 50%.

Пример. Способ осуществляют согласно примеру 2, но на стадии гидрофобной хромато рафии вместо октил-сефарозы используют октил-агаро- зу (Сигма, США). Колонку с носителем

(200 мл) уравновешивают 0,1 М калийфосфатным буфером, 0,01 М ЭДТА, 40%- ным сульфатом аммония, рН 7,0. Препарат фермента наносят на колонку, промывают ЬОО мл исходного буфера и элюируют линейным нисходящим гради0 ентом общим объемом 500 мл 40%-ного сульфата аммония в 0,1 М калий-фосфатном буфере, 0,01 М ЭДТА, рН 7,0. Скорость элюции составляет 0,5- 1,0 мл/см2 Ч. Удельная активность

5 Ю мкмоль/минiMr. Выход 30%.

П р и м е р 8. Способ осуществляют согласно примеру 1. Далее после стадии гидрофобной хроматографии объединенные фракции фермента очищают

0 путем разделения по молекулярным массам методом ультрафильтрации с использованием мембран Амикоп (Голландия) . К исходному раствору по мере его фильтрации добавляют 1 объем

5 (от 50 до 100 мл) 0,05 М калий-фосфатного буфера, 0,01 М ЭДТА, рН 7,8. На первом этапе используют мембраны ХМ-100 с отсекающей молекулярной массой 100 кДа. На втором этапе элюат

0 очищают и концентрируют с использованием мембран РМ-30 с отсекающей молекулярной массой 30 кДа. Уд гльная активность фермента 12 мкмоль/мин«Mr, Выход 20%.

35

Формула изобретения

1. Способ выделения НАД-зависимой формиатдегидрогеназы, включающий

фракционирование сульфатом аммония гомогената клеток микроорганизма-продуцента с последующей хроматографи- ческой очисткой целевого продукта, отличающийся тем, что, с

целью увеличения удельной активности препарата и упрощения процесса, очистке подвергают супернатант, полученный после осаждения сульфатом аммония, а хроматографическую очистку

выполняют методом гидрофобной хрома- тографиии в условиях нисходящего градиента ионной силы на носителях, имеющих в качестве заместителей октиль- ную группу.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, ч го осаждение сульфатом аммония ведут до степени насыщения 40%.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что после гидрофобной хроматографии осуществляют дополнительную очистку методом разделения белков по Молекулярной массе.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способам выделенияНАД-зависимой формиатдегидрогеназы (КФ1.2.1.2). Цель изобретения - увеличение удельной активности препарата и упрощение процесса. Фермент выделяют следующим образом: экстракт, приготовленный разрушением клеточной суспензии, осаждают сульфатом аммония до насыщения 40%, а супернатант без обессоливания подвергают гидрофобной хроматографии в условиях нисходящего градиента ионной силы на носителе, содержащем в качестве заместителя октильную группировку. Удельная активность препарата 11 мкмоль/мин.мг. Выход 53%. Для достижения большей степени очистки проводят дополнительную очистку методом разделения белков по молекулярной массе. После очистки гель-проникающей хроматографией получают препарат фермента с удельной активностью 15 мкмоль/мин.мг и выходом 40%. 2 з.п. ф-лы, 1 табл.

Бесклеточный

экстракт 8700 5500 Фракционирование 40% сульфатом аммония 7000 4900 Гидрофобная хроматография на октил-сефарозе290 2900

Гель-проникающая хроматография на сефакрилс 145 2200

Примечание. Очистка бактериальной формиатдегидрогеназы на

50 г биомассы Fseudomonas sp.101.

1,1

17

25

100

90

53

40