Способ выделения гиалуронидазы Советский патент 1983 года по МПК C12N9/26 C12R1/44 

Изобретение относится к фермер тнбй промышленности, в частности к способам получения высо1соочищенной гиалуронидазы из -патогенных микроорганизмов.

Известны способы получения тести кулярной- гиалуронидазы, в частности гиалуронидазы из бычьих семенников, из хрусталика глаза Cl 3Однако указанное сырье является дорогостоящим и дефицитным, что ограничивает получение фермента в до.статочном количестве,

Известны также способы получе ния гиалуронидазы на основе гликроорганизмов сак патогенных, так и непатогенных.

Среди непатогенных микроорганизмов редко встречаются продуценты гиалуронидазы. Более распространенными являются способы выделения гиалуронидазы из культуральных жидкостей патогенных микробов.

Известен способ выделения гиалуi

ронидазы из культуральной жидкости патогенного стафилококка путем осаждения фермента сернокислыми солями.

Получают неочищенный ферментный препарат, выход и активнос7ь которого не охарактеризованы 2,

Наиболсзе близким к изобретению по технической сугцности и достигаемому эффекту является способ выделения гиалуронидазы из культуральной жидкости патогенного штамма-продуцента CEcsfridiuin perfrin- gens путем осаяудения сульфатом аммония, диализа, повторного осаждения сульфатом аммония, растворения осадка, осаждения этиловьгм спиртом при соотношении 1;1, отделения и растворения осадка с последующей хроматографИческой очисткой на ди этиламиноэтилсефадексе А-50, причем собцию ведут в условиях 0,1 М триобуфера (рН 7,5) , а ЭЛК5ЦИЮ осуществляют 1М NaC2 в том же буфере Сз „

Получаек Ый продукт обладает значительной чистотой, однако при проверке чистоты выделенной гиалуронидзы методом электрофореза установлено, что она состоит из двух электрофоретических фракций.

Цель изобретения - повышение чистоты целевого продукта.

Указанная цель достигается предлагаемым способом выделения гиалуронидазы из культуральной жидкости патогенного штамма-продуцента путем осаждения фермента этиловым спиртом в соотношении 1:1, отделения и растворения осадка с последующей хроматографической очисткой на полисахаридном сорбенте, причем непользуют культуральную жидкость шта ма StaphyPococcus 0-15, в кач:естве сорбента используют диэтиламиноэтилцеллюлозу, причем при хром тогрг1фии сорбцию-ведут в условиях 0,006 М фосфатного буфера с рН 7,0-7,20,а элюцию осуществляют 0,06 фосфатным буфером при тех же значениях рН.

Предлагаемый способ позволяет отделить примесные белки и сопутствующие токсины и получить электрофоретически гомогенную гиалуронидазу, что обусловлено свойствами культуральной жидкости указанного штамма и определенными условиями хроматографии .

Кроме того, предлагаемый способ является более простым, состоит из иеньшбзго числа стадий, чем известный .

Пример. Продуцент St.ateus 0-15 культивируют в течение 5 сут на среде, содержащей кислотный гидролизат козеина, экстракт отрубей, дрожжевой экстракт и однозамещенный фосфат калия.

Микробные клетки отделяют сепарированием. К 1.Л культуральной жидкости добавляют 1 л охлшкденнрго 96%-ного этилового спирта, вьшерживают в холодильнике 3,0 мин, центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 мин. Осадок растворяют в 50 мл дистиллированной воды и лиофильно высушивают. Получают порошок с активностью около 12 ед/мг.

Выход фермента по активности составляет около 90% от исходной активности в культуральной жидкости. Из 1 л культуральной жидкости получают 1,070 г лиофильно высушенного ферментного препарата.

100 мг полученного ферментного препарата растворяют в 0,006 М фосфатном буфере с рН 7,0 и наносят на колонку с ДЭАЭ-целлюлозой в ОН -форме. Высота колонки 22 см, в ысота слоя 15 см, диаметр колонки 2 см, скорость нанесения 1 капля в 15 с, Недсорбированный белок выливают из колонки тем же буфером. Актизную фракцию гиалуронидазы эллюируют фосфатным буфером с рЧ 7,0 и ионной силой 0,06 М. В элюате удельная активность гиалуронидазы составляет 72 ед/мг белка. Элюат высушивают лиофильно,

Активность гиалуронидазы определяют турбидиметрическим методом. Гомогенность полученного фермента определяют электрофорезом в полиакрил амидном геле при кислом и щелочном значениях рН среды.

Выделенная гиалуронидаза злектрофоретически гомогенна, имеет активность 67000-120000 турбидиметрических единиц на 1 г.

Выход целевого продукта 62% по сравнению с исходной активностью в культуральной жидкости.

3104 9544

Таким образом, предлагаемый спо- Фермент гиалуронидаза, полученсоб получения фермента гиалуронидазыный предлагаемым способом, обладает

легко воспроизводим и не требуетвысокой удельной активностью, гомоспециального сложного аппаратурногогененэлектрофоретическйи полностью

оформления.свободен от токсических компонентов.

СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ГИАЛУРОНИДАЗЕ. из культуральной жидкости патогенного штамма-продуцента путем осаждения фермента этиловым спиртом в соотношении 1:1, отделениями растворения отгадка с последующей хроматографической очисткой на полисахаридном сорбенте, отличающийся тем, что, с целью повыиления чистоты целевого продукта, используют культуральную жидкость штамма Staphy2OCOCCUS aPbus 0-15, в качестве сорбента используют диэтилг аминоэтилцеллюлозу,причем при хроматографии сорбцию ведут в условиях 0,006 М фосфатного буфера с рН 7,0-7,2, а элюцию осуществляют О ,06 М фосфатным буфером при тех же значеО) ниях рН. | со СП til 4