ШТАММ STREPTOMYCES CHROMOBUSCUS - ПРОДУЦЕНТ БИОТИНСВЯЗЫВАЮЩЕГО БЕЛКА Российский патент 1995 года по МПК C12P21/00 C12N1/14 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при проведении иммунохимического анализа в иммунологии, медицине и клеточной биологии.

Известен выделенный из почв Ленинградской области штамм Streptomyces chromofuscus Т-200 (штамм хранится во Всесоюзной коллекции микроорганизмов в ИБФМ под номером ВКМ Ас-1268Д), образующий 6 мг/л биотинсвязывающего белка, который принят за прототип. Однако уровень синтеза БСБ этим штаммом (6 мг/л) недостаточно высок, что является препятствием для использования этого штамма в промышленности.

Целью изобретения является создание штамма микроорганизма, значительно превышающего по уровню биосинтеза БСБ прототип Streptomyces chromofuscus Т-200.

Штамм по изобретению получен из штамма Т-200 под действием мутагена 1,2,7,8-диэпоксиоктана и отбора по устойчивости к 2-(4-гидроксифенилазо)-бензойной кислоте с последующей селекцией на подобранных средах. Штамм по изобретению хранится во Всесоюзной коллекции микроорганизмов в ИБФМ под номером ВКМ Ас-1329 Д.

Существенные признаки заявляемого штамма Streptomyces chromofuscus ВКМ Ас-1329Д, общие с прототипом.

Предлагаемый штамм и прототип на большинстве агаризованных сред образуют бархатистые колонии, растворимый пигмент отсутствует. Хорошо растут при 20^оС. Молоко пептонизируют, желатину разжижают, на клетчатке не растут. Растут в присутствии арабинозы, глюкозы, ксилозы, рамнозы, фруктозы, маннита, инозита; не растут на среде с сахарозой и раффинозой. Подавляют рост грамотрицательных бактерий и дрожжей. При глубинной ферментации накапливают в культуральной жидкости БСБ.

Отличительные признаки предлагаемого штамма от известного (прототипа).

Заявляемый штамм отличается от прототипа морфологическими особенностями имеет изогнутые спороносцы. Штамм устойчив к 2-(4-гидроксифенилазо)-бензойной кислоте в концентрации 200 мг/мл.

Заявляемый штамм в 5-7 раз превосходит по уровню биосинтеза БСБ прототип (заявляемый штамм 30-40 мг/л, прототип 6 мг/л).

Морфолого-культуральные, физиологические и антагонистические признаки штамма Streptomyces chromofuscus ВКМ Ас-1329Д.

Морфолого-культуральные признаки.

Заявляемый штамм образует изогнутые спороносцы, расположенные в виде кистей. Споры овальные с гладкой оболочкой. На среде Чапека с крахмалом на 20 сут. роста при 28^оС образуют колонии 6-8 мм в диаметре с волнистым краем. Воздушный мицелий бледно-серовато-фиолетовый (а-5) или белый (а-6), субстратный мицелий буроватый (б-4). Растворимых пигментов нет.

На крахмалоаммиачном агаре при тех же условиях колонии 10-12 мм в диаметре. Воздушный мицелий от серо-фиолетового (н-2), розовато-лилового (ж-3), до бледно-сероватого (а-6). Субстратный мицелий темно-пепельно-серый (в-4), растворимых пигментов нет.

На крахмально-кукурузных средах колонии 10-12 мм в диаметре. Воздушный мицелий от серовато-фиолетового (а-3), пепельно-серого (к-2) до бледно-серовато-фиолетового (а-5). Субстратный мицелий от темно-песочного (з-6) до орехового (к-5) и сигарного (д-7).

На органической среде колонии мелкие до 3-4 мм в диаметре. Воздушный мицелий белый (д-3), развит слабо, имеется только по краю колонии, субстратный мицелий буроватый (б-4). Образует незначительное количество растворимого пигмента.

Физиолого-биохимические признаки.

Меланоидные пигменты образует слабо. Молоко пептонизирует, желатину разжижает. На клетчатке не растет. На среде Придхэма-Геттгиба растет в присутствии арабинозы, глюкозы, ксилозы, рамнозы, фруктозы, маннита, инозита. Не растет на среде с сахарозой, раффинозой.

Штамм по изобретению использует в качестве источников азотного питания различные соединения минерального азота нитраты, аммонийные соли; хорошо усваивает органический азот в виде пептона и аспарагиновой и глутаминовой аминокислот.

Штамм по изобретению имеет температурный оптимум для роста и развития 25-30^оС, минимальная температура роста 5-10^оС, выдерживает максимальную температуру 37-40^оС. Штамм растет и образует БСБ в интервале рН от 5,6 до 8,5. Изменение режима температуры и рН ведет к прекращению роста культуры.

В основном исследования проводились на регламентных средах, приведенных ниже, которые давали положительный эффект без использования стимуляторов. Дополнительно было показано, что при добавлении в регламентную посевную среду 0,5% дрожжевого экстракта или 1,5% кукурузного экстракта наблюдается стимуляция роста мицелия.

Условия хранения предлагаемого штамма.

Штамм хранится на агаризованной крахмало-аммиачной среде при температуре 4^оС в течение 3 месяцев. Срок хранения в виде спор в лиофильно-высушенном состоянии и в жидком азоте (-196^оС) с использованием в качестве криопротектора 2,5%-ного раствора желатины с глюкозой (1 1) 1 год.

Антагонистические признаки.

Штамм проявляет антагонистические свойства в отношении грамотрицательных бактерий, дрожжей сахарамицетов и кандид, не действует на грамположительные бактерии.

Заявляемый штамм не токсичен и не относится к микроорганизмам, обладающим патогенными свойствами.

При глубинной ферментации предлагаемый штамм накапливает в культуральной жидкости БСБ.

Условия образования БСБ.

Для получения БСБ штамм культивируют при 28 ± 2^оС на качалке (n 220 об/мин) в колбах Эрленмейра вместимостью 750 мл, содержащих 100 мл среды следующего состава, г/л: глюкоза 50; сульфат аммония 6; хлорид калия 0,4; сульфат магния 0,2; дигидрофосфат калия 0,4; карбонат калия 8; рН после стерилизации 6,8-7,0. Колбы инокулируют по 10 мл посевного материала, полученного двухсуточным культивированием в колбах Эрленмейра вместимостью 750 мл (28 ± 2^оС, 220 об/мин), содержащих по 100 мл среды следующего состава, г/л: перевар Хеттингера 0,28 по аминному азоту; пептон 5; натрий хлористый 5; глюкоза 10; рН естественный.

Для приготовления посевного материала использовали косяки с агаризованной средой следующего состава, г/л: крахмал 10; дигидрофосфат калия 1; сульфат магния семиводный 1; хлорид натрия 1; сульфат аммония 2; карбонат кальция 2; раствор солей микроэлементов 1 мл; агар 20; рН после стерилизации 7,0. Раствор солей микроэлементов: сульфат железа семиводный 0,1 г; хлорид марганца четырехводный 0,1 г; сульфат цинка семиводный 0,1 г; дистиллированная вода до 100 мл. Косяки инкубировали 9-14 сут. при 28 ± 2^оС.

Для получения БСБ ферментацию проводили в течение 7 сут. Концентрация БСБ в указанных условиях 30-40 мг/л при определении с 2-(4-гидроксифенилазо)-бензойной кислотой (N.M. Green // Meth. Enzymol. 18. A. 1970).

По окончании ферментации мицелий отделяют центрифугированием. Супернатант концентрируют в 10-15 раз на мембранах УАМ-100. Концентрат забуферивают тетраборатом натрия в концентрации 0,05 моль/л до рН 11,0; вносят хлористый натрий до концентрации 1 моль/л. Осадок кальциевых солей удаляют фильтрованием. Фильтрат наносят на колонку с иминобиотин-сфероцеллом (ВНИИОЧБП, г. Ленинград), уравновешенную щелочным боратным буфером. Отношение объема фильтрата к объему хроматографического носителя 1 6. Колонку промывают четырехкратным (по отношению к носителю) объемом буферного (боратного) раствора. Элюцию БСБ проводят двукратным объемом 0,1 моль/л натрий-ацетатного буфера рН 4,0, содержащего хлористый натрий в концентрации 0,5 моль/л. Элюат обессоливают и БСБ лиофилизируют из воды.

Чистота препарата по данным электрофореза в полиакриламидном геле составляет не менее 97% Биотиновое число (количество микрограмм биотина, связываемое 1 мг БСБ) составляет не менее 16,0 по данным спектрофотометрического титрования биотином.

Использование: биотехнология, проведение иммунохимического анализа в иммунологии, медицине и клеточной биологии. Штамм Streptomyceschromofuscus Т
201 при культивирования в жидкой питательной среде образует биотинсвязывающий белок. Штамм получен под действием мутагена 1, 2, 7, 8-диэпоксиоктана и отбора по устойчивости к 2-(4-гидроксифенилазо)-бензойной кислоте из штамма Streptomyces chromofuscus Т 200. Штамм Streptomyces chromofuscus Т 201 отличается от штамма Т 200 морфологическими, генетическими свойствами и образует в 5 7 раз больше биотинсвязывающего белка. Состав питательной среды для биосинтеза биотинсвязывающего белка, г/л: глюкоза 50; сульфат аммония 6; хлорид калия 0,4; сульфат магния 0,2; дигидрофосфат калия 0,4; карбонат калия 8. Биотинсвязывающий белок выделяют из культуральной жидкости, концентрируя его на мембранах УАМ 100 с последующей аффинной хроматографией на иминобиотиновом сорбенте. Чистота препарата по даннным электрофореза в полиакриламидном геле составляет не менее 97% Биотиновое число составляет не менее 16,0 по данным спектрофотометрического титрования биотином. Биотинсвязывающий белок не токсичен.

Штамм актиномицета Streptomyces chromofuscus Bkm Ас-1329 D -продуцент биотинсвязывающего белка.