Штамм стрептомицета SтRертомYсеS снRомоFUSсUS - продуцент биотинсвязывающего белка Советский патент 1991 года по МПК C12N15/81 

1

(2) 4601599/13

(22) 04.11.88

(46) 23.04.91. Бюл. № 15

(71)Всесоюзный научно-исследова- тельский технологический институт антибиотиков и ферментов медицинско- го назначения и Институт цитологии АН СССР

(72)А.П.Кашкин, О.В.Аак, Н.А.Корчагина, Ю.Е.Конев, К.И.Галактионов, В.Г.Демин и Ю.А.Лазебник

(53)612.017.1-064(088.8)

(56)Archives of Biochemistry and Biophysics, 1964, v. 106, p. 1-5.

(54)ШТАММ СТРЕПТОМИЦЕТА STREPTOMYCES ,CHROMOFUSCUS - ПРОДУЦЕНТ БИОТИНСВЯЗЫВАЮЩЕГО БЕЛКА

(57)Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при проведении иммуноферментного

и иммунофлуоресцентного анализа в иммунологии, медицине и биологии. Целью изобретения является повышение продуктивности штамма. Штамм Strep- tomyces chromofuscus выделен из почв Ленинградской области в ходе скрининга микробных продуцентов биотинсвя- зывающих белков. Штамм синтезирует биотинсвязывающий белок, концентрация которого в культуральной жидкости составляет 6 мг/л, не токсичен, не патогенен, гидролизует молоко, разжижает желатину, на клетчатке не растет, на среде Придхэма-Готглиба растет в присутствии арабинозы, Ксилозы, глюкозы, рамнозы, фруктозы, маннита, т-инозита. Не растет на среде с сахарозой и рафинозой. Штамм депонирован во Всесоюзной коллекции микроорганизмов под номером ВКПМ Ас 1268Д.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при проведении иммуноферментного и имму- нофлуоресцентного анализа в иммунолог гии, медицине и клеточной биологии.

Целью изобретения является повышение продуктивности штамма.

Штамм Streptomyces chromofuscus Т-200 выделен из почв Ленинградской области- в ходе скрининга микробных . продуцентов биотинсвязывающих белков. Штамм хранится во Всесоюзной коллекции микроорганизмов под номером ВКПМ Ас 1268Д.

/ Штамм характеризуется следующими признаками.

Культурально-морфологические признаки. Спороносцы спиральные, расположены моноподиально и в виде кистей. Споры овальные с гладкой оболочкой.

Агар Чапека с крахмалом.Воздушный мицелий серый, по краям колоний бе- лый. Субстратный мицелий светло-серый. Растворимых пигментов нет.

Глицерин-аспарагиновый агар. Воздушный мицелий светло-серый, беловатый. Субстратный мицелий буроватый. Растворимых пигментов нет.

to И

рэ

Ь

Крахм,inьно-аммиачный агар Воз- душный мицелий сероватый. Субстрат ный мицелий желтовато-серый Растворимых пигментов нет.

Органическая среда 2. Воздушный мицелий белый. Субстратный мицелий буроватый. Растворимый бурый пиг- мент образует слабо.

Физиологе-биохимические признаки. Меланоидные пигменты образует слабо. Молоко пептонизирует, желатину раз- жижает. На клетчатке не растет. На среде Придхэма-Готтлиба растет в присутствии арабинозы, глюкозы, кси- лозы, рамнозы, фруктозы, маннита, инозита. Не растет на среде с сахарозой, рафинозой

Штамм не относится к микроорга- низмам, обладающим патогенным деист вием.

Пример 1. Штамм Strep chro mofuscus T-200 выращивают в ферментаторе объемом 40 л с барботажем и

постоянным перемешиванием в течение 5 сут при 28+2°С на питательной среде следующего состава, Глюкоза5

(NH4)fcS040,6

MgS040,02

КС10,2

CaCOg0,8

КН2РОФ0,04

Для приготовления посевного материала используют косяки с агаризиро- ванной средой следующего состава, мас.%:

Кукурузный

экстракт0,5

Крахмал не-

растворимьй1,0

(NH4)2S040,3

СаС030,3

Агар2,5

инкубированные в течение 48 ч при

28+2°С.

По окончании ферментации культу- ральную жидкость фильтруют, натив- ный раствор, освобожденный от мицелия, концентрируют примерно в 10 раз на ультрафильтрационной установке с использованием мембраны Рипор 4-120 Далее 0,56 л концентрата используют для выделения биотинсвязывающего белка (БСБ)

На первой стадии проводят высаливание 70%-ным сульфатом аммония, вы- павший осадок отделяют от надосадоч- ной жидкости центрифугированием

Q

Q

5

0

5

0

5

0

5

15000 g при 4°С и ре суспендируют в 60 мл дистиллированной воды. Полученный раствор диализуют против дистиллированной воды. Диализат центрифугируют при 15000 g 30 мин. Супер- натант используют дпя окончательной очистки биотинсвязывающего белка ме- тодом аффинной хроматографии на ими- нобиотинаг ароз е.

Хроматографию проводят следующим образом. Колонку, наполненную 1 мл иминобиотин-агарозы, уравновешивают 10 мл буферного раствора, содержащего 0,05 М NazC03 и 0,5 М NaCl, pH 11,0 (буфер 1). К белковому препарату добавляют 0,1 об. 10-кратного концентрата буфера 1, после чего 9 мл полученного раствора пропускают через колонку со скоростью 1 мл/мин После нанесения сорбент промывают 20 мл буфера I. Элюцию проводят 4 мл 0,05 М ацетатного буфера, рН ,4,0 (буфер II). По окончании элюции колонку промывают 20 мл буфера II и 20 мл буфера I, после чего цикл хроматографии повторяют. За 8 циклов выделения получено 34 мг белка. Таким образом содержание БСБ в культу- ральной жидкости составляет не менее 6 мг/л Гомогенность полученного препарата определяют методом электрофореза в полиакриламидном геле. Чистота препарата выше 97%,

Белок, продуцируемый штаммом, идентифицирован как стреитавидин на основании следующих данных: белок обладает биотинсвязывающей способностью; белок может быть выделен методом аффинной хроматографии на имино- биотин-сефарозе при режиме, установленном для авидина и стрептавидина; молекулярная масса белка - 60 КД; субъединичное строение белка с молекулярной массой субъединицы 15 КД; коэффициент экстинкции 1%-ного раствора белка равен 3,2

Пример 2 В лунки планшетов для иммуноферментного анализа вносят по 100 кг биотинилированных иммуноглобулинов кролика, растворенных в 0,1 М бикарбонате натрия. После 2 ч инкубации лунки проминают буфером, содержащим 20 мМ (рН 7,4), О,Г5 М NaCl и 0,05% твин-20 (буфер III) и вносят БСБ в количестве 0,001- 1 мкг на лунку на 100 мкл буфера III. Через 15 мин инкубации лунки промывают буфером III и вносят в них раст51

вор биотинилированной пероксидазы в количестве 0,2 мкг на лунку. Через 15 мин инкубации планшет промывают буфером III и в лунки вносят по 50 мкл раствора о-фенилендиамина с концентрацией 1 мг/мл цитратного буфера, рН 4,5. Буфер содержит 0,012% . Экстинкцию раствора в лунках определяют на приборе Нуль- тискан. Параллельно все процедуры анализа проводят с использованием вместо БСБ авидин. Сравнительные результаты анализа показывают, что полученный из культуральной жидкости БСБ пригоден для иммуноферментного анализа, причем рабочая концентрация БСБ в 8 10 раз ниже концентрации авидина.

О&

Таким образом, продуктивность штамма составляет 6 мг/л при низком уровне пигментообразования и накопления в культуральной жидкости балластных белков, что позволяет упростить процесс выделения конечного про дукта, сократить продолжительность химической очистки и обеспечивает получение высокоочищенного биотин- связывающего белка в иммунохимичес ком анализе, превосходящем авидин, получаемый из пищевого сырья.

Формула изобрет.ения

Штамм стрептомицета Streptorayces chromofuscus ВКПМ Ас 1268Д продуцент биотинсвязывающего белка.