СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХФЕРМЕНТОВ Советский патент 1967 года по МПК C12Q1/38 

Известны способы определения активности нротеолитических ферментов по степени гидролиза белка. Так, согласно одному из них, на белковый субстрат действуют раствором ферментного препарата, после чего определяют оптическую плотность раствора гидролизата по интенсивности окрашивания присутствующего там тирозина с реактивом Фолииа. По найденному значению оптической нлотности судят о степеии гидролиза белка.

Предлагаемый снособ но сравнению с известными дает более точные результаты определения, он прогце и быстрее.

Суихность его заключается в том, что об активности протеолитических ферментов судят но общему количеству продуктов гидролиза белка, определяемому на интерферометре по разности показателей преломления между гидролизатом и контрольным раствором (эталоном). Оба раствора перед определением разности их показателей преломления освобождают от ненрогидролизованного белка одним из известных снособов, например, путем осаждения раствором трихлоруксусной кислоты с последующей фильтрацией.

Предлагаемый снособ заключается в следующем.

3 мин при 30°С. Затем к реакционной жидкости добавляют 4%-ный раствор трихлоруксусной кислоты для инактивации фермента и осаждения непрогидролизованного белка. Одновременно ставят контрольный опыт, для чего исследуемый ферментный раствор инактивируют 4%-ным раствором трихлоруксусной кислоты и приливают 1%-ный раствор субстрата, при соблюдении количественного соотношення, указанного выше.

Оба раствора выдерживают при 30°С в течение 15 мин для обеспечения полноты осаждения белка, после чего фильтруют. В прозрачном фильтрате определяют разность преломления исследуемого и контрольного растворов на интерферометре. По нолученному значенню разности ноказателей нреломлення (Дп) судят о протеолитической активности фермента, нодставляя это значение в следующее уравнение:

для грибных препаратов

,j 0,1702 Ад -10,213

/ 5

25 ДЛЯ бактериальных препаратов

0,1881 Д и -14,528

т - количество взятого для протеолиза препарата в г;

Д« - разность показателей преломления;

0,1702; 10,213; 0,1881; 14,528 постоянные коэффициенты, найденные экспериментальным путем.

Предмет изобретения

Способ определения активности протеолитических ферментов по степени гидролиза белка, отличающийся тем, что, с целью повышения точности определения и ускорения процесса, степень гидролиза белка определяют по общему количеству прогидролизованных продуктов, устанавливаемому на интерферометре по разности показателей преломления между гидролизатом и контрольным раствором (эталоном), при этом оба раствора перед определением разности их показателей преломления освоболадают от непрогидролизованного белка одним из известных способов, например путем осаждения раствором трихлоруксусной кислоты с последующей фильтрацией.

н

.,