СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ПЕКТОЛИТИЧЕСКИХФЕРМЕНТОВ Советский патент 1967 года по МПК C12Q1/34 

Известен способ определения активности пектолитических ферментов путем ферментативного гидролиза раствора пектина с последующим количественным определением расщепленного пектина.

Предложено после процесса гидролиза на гидролизат действовать сернокислым цинком, инактивируя при этом ферменты и осаждая продукты пектолиза. По количеству продуктов пектолиза, не осажденных сернокислым ци;: ком, судить о количестве расщепленного в процессе гидролиза пектина, причем JTO количество неосажденных продуктов определять на интерферометре по разности показателей преломления между исследуемым раствором и контрольным (эталоном).

Это повышает точность определения и ускоряет процесс.

Способ заключается в следующем. В пробирку наливают 20 мл 1о/о-иого раствора свекловичного пектина и 10 уил ферментного раствора, приготовленного на разбавителе. Содержимое пробирки перемешивают и выдерживают в термостате при 30°С в течение 1 час для проведения реакции гидролиза пектина. После этого к реакционной жидкости добавляют 2 /ил 150/о-ного раствора сернокислого цинка для инактивации фермента и для осаждения макромолекулярных продуктов пектолиза. Содержимое пробирки перемешивают и фильтруют.

Полученный прозрачный раствор является исследуемым. Одновременно готовят контрольный раствор. Для этого в пробирку наливают 2 мл 15%-ного раствора сернокислого

цинка, 20 лгуг дистиллирова1П10й воды и Юлгл того же ферментного раствора. Содержимое пробирки перемешивают.

Затем интерферометром ИТР-2 определяют разность показателей преломления исс.чедуемого и контрольного растворов (Д«), получаемую в результате наличия не осаждаемых сернокислым цинком продуктов пектолиза в исследуемом растворе.

Замер Д/г производят в кювете с длиной

грани 4 см.. Для получения точных результатов необходимо брать на анализ такое количество ферментного материала, чтобы Д/г - 250- -1250. За единицу пектолитической активности принимают такое количество фермента, которое гндролизует 1 г пектина до продуктов, не осаждаемых раствором сернокислого цинка, прн соблюдении строго определенных следующих условий. Количество субст- -20 мл 1о/о-ного растрата

вора свекловичного пектина - 10 мл

Количество ферментного раствора3 3,9-4,1 Величина рН реакционной средыВремя гидролиза 1 Соотношение фермент-субстрат в среде, обеспечивающее гидролиз пектина на 30%. Количество .осади- 2 мл 15о/о-ного раствотеляра сернокислого цинПолученное значение Ли подставляют в следующее уравнение: 0,07585 - А/г+ 12,59 ПкЛ, ИЛИ ед/мл, те- 1000 где ПиАц - пектолитическая активность анализируемого ферментного материала, в принятых единицах; т - количество ферментного материала, взятого на анализ в г или мл; 0,07585, 12,59 и 1000 - постоянные коэффициенты, полученные по законам аналитической геометрии. Эю уравнение составлено на основе изучения зависимости между разностью показателей преломления исследуемого и контрольного растворов и количеством единиц активности ферментного препарата, взятого для проведения ферментативной реакции. Пример. Для анализа препарата фермента Aspergillus niger берут навеску его в 0,1 г и переводят ее в колбу на 50 см, разбавителем доводят объем в колбе до метки. Перемешав содержимое колбы, берут из нее 10 мл раствора и переносят в колбу на 50 см, доведя объем разбавителя до метки. Затем из полученного перемешанного раствора отбирают 10 мл для проведения ферментативной реакции, что соответствует содержанию ферментного препарата в количестве 4 мг. Лосле приготовления исследуемого и контрольного растворов определяют Ага на интерферометре. Оно равно 733. Подставив это значение в уравнение, находят ,-j, 0,07585.733 + 12.59 .-.р .. 0,004.1000 ° При определении активности пектолитическик фермеитов по описываемому способу расхождение в среднем составляет ±2,5о/о, а это значит, что способ более точен. Предмет изобретения Способ определения активности пектолитических ферментов путем ферментативного гидpojjHja раствора пектина с последующим количественным определением расщепленного пектина, отличающийся тем, что, с целью повышения точности определения и ускорения процесса, после процесса гидролиза производят осаждение продуктов пектолиза и инактивацию ферментов сернокислым цинком, а количественное определение расщепленного в процессе гидролиза пектина проводят по количеству продуктов пектолиза, не осажденных сернокислым цинком, причем это количество устанавливают на интерферометре по разности показателей преломления между исследуемым раствором и контрольным (эталоном).