СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФЕРМЕНТНЫХ ПРЕПАРАТОВЛИЗОЦИЛ\ОВ Советский патент 1968 года по МПК C12N9/36 

Известен способ получения ферментных препаратов лизоцимов из содержащего их сырья путем приготовления из этого сырья солевого раствора, содержащего хлористый натрий в концентрации от 0,5 до 1,0 и имеющего рН от 5 до 5,5, адсорбции лизоцимов из полученного раствора на хитине, промывки хитина солевым раствором для удаления несорбирующихся примесей, содержащихся в исходном сырье, с -последующей десорбцией лнзоцимов дистиллированной водой.

Полученный известным способом лизоцим представляет собой гомогенный белковый препарат, содержащий примеси около 5% хлористого натрия и следы углеводов.

Для освобождения лизоцима от этих примесей проводят сорбцию лизоцима из раствора, полученного .после первичной сорбции, причем в этот раствор добавляют фосфаты натрия или калия, доводя рН до 8. Примеси удаляют водой, а лизоцим затем десорбируют 0,5 - 1,0%-ной уксусной кислотой.

Для упрощения процесса получения очищенных ферментных препаратов лизоцимов согласно лр едлагаемому способу хитин предварительно модифицируют путем обработки его разбавленной азотистой кислотой цри температуре, предпочтительно равной от 2 до 4, и рН раствора от 2 до 3°С.

По предлагаемому способу солевой раствор, содержащий лизоцимы, следует приготовлять путем смешивания исходного сырья с бикарбонатом натрия или со смесью бикарбоната и карбоната аммония до получения раствора с концентрацией солей от 0.5 до 1,0% и рН 7.9- 8,4.

Кроме того, целесообразно хитин после промывки солевым раствором промывать дистиллированной водой для удаления солей, после чего лизоцим десорбировать 3-5%-ной уксусной кислотой.

Предлагаемый способ заключается в следующем. Получаемый из природного сырья извеетным сиособом хитин содержит евободные аминогруппы, придающие ему свойства анионообменника и снижающие его специфичность как сорбента лизоцимов.

Для устранения этих свойств целесобразно обработать такой хитин азотистой кислотой, в результате чего аминогруппы заменяются гидроксильньши группамп, не обладающими ионообменными свойствами.

Модификацию хитина ведут в 0,3-0,5%ном растворе азотистой кислоты при 2-4°С.

По механическим и физикo-xи.ичecкпм свойствам полученный при этом хитин не отличается от исходного. 1 г модифицированного хитина со средним диаметров частиц от 150 до 200 мк сорбирует около 15 -иг лизоцима. Выделение лизоцима из содержащего его сырья € помощью получеиного .вышеуказанным способом еорбента проводят следующим епособом. В исходный раствор (сок, экстракт, биологическую жидкость) вносят бикарбонат натрия (или смесь бикарбоната и карбоната аммония) до концентрации 0,5-1,0о/о и устанавливают рН в интервале от 7,9 до 8,4. Полученный раствор пропускают через слой хитина. Лизоцим при этом полностью сорбируется на хитине. Несорбирующиеся примеси, содержащиеся в исходном сырье, удаляют путем промывания сорбента раствором бикарбоната натрия (или смеси бикарбоната и карбоната аммония) с теми же значениями рН и концентрации. После этого сОрбент промывают водой, удаляя таким образом соли. Лизоцим десорбируют 3-5%-ной уксусной кислотой. После отмывки его от уксусной кислоты дистиллированной водой хитин может быть использован для очередной операции извлечения лизоцима. Пример 1. В качестве исходного сырья использовали белок одного куриного яйца (25 мл). Его разбавляли до 250 мл ,1о/о-ным раствором NaHCOg. Полученный раствор пропускали через колонну (2x30 см) с хитином, диаметр частиц которого составлял от 150 до 200 мк (в колонку предварительно промывали 1%-ным раствором NaHCOs). Отмыли 1о/о-ным раствором NatiCOs; контроль за отмывкой проводили путем измерения оптической плотцости вытекающего из колонки раствора при 280 ммк яа спектрофотометре СФ-4. Затем колонку промывали водой до удаления NaHCOa, контролируя отмывку пробой на окрашивание пламени газовой горелки. Лизоцим десорбировали 5%-ным раствором CHgCOOH и леофильно высушивали. Выход лизоцима составил около 120 мг. Ферментативная активность его совпадала с активностью стандартного препарата лизоцима, полученного методом прямой кристаллизации. П р и м ер 2. В качестве исходного сырья использовали сок (около 400 мл), отжатый из 1 кг неочищенной репы. К соку добавляли сухой NaHCOa До концентрации 1% и центрифугировали для удаления механичес-ких частиц. Затем из этого очищенного раетвора выделяли ЛИЗОЦИМ так же, как в примере 1. Выход лизоцима составил около 10 мг, ферментативная активность его равнялась от активности лизоцима из белка куриных яиц в расчете на единицу веса лиофильно сухих препаратов. Предмет изобретения 1. Способ получения ферментных препаратов лизоцимов из содержащего их сырья путем .приготовления из этого сырья солевого раствора, адсорбции лизоцимов из полученного раствора на хитине, промывки хитина солевым раствором для удаления несорбирующихся примесей, содержащихся в исходном сырье, с последующей десорбцией лизоцимов, отличающийся тем, что, с целью упрощения процесса получения очищенных ферментных преПаратов, хитин предварительно модифицируют путем обработки его разбавленной азотистой кислотой. 2.Способ по п. 1, отличающийся тем, что модификацию хитина проводят при температуре от 2 до 4° и рН раствора от 2 до 3°С. 3.Способ по п. 1, отличающийся тем, что солевой раствор, содержащий лизоцим.ы, приготавливают путем смешивания исходного сырья с бикарбонатом натрия или со смесью бикарбоната и карбоната аммония до получения их Концентрации 0,5-ID/Q и рН раствора 7,9-8,4, а в качестве солевого раствора, применяемого для промывки хитина, используют 1%-ный раствор бикарбоната и карбоната аммония. 4.Способ по п. I, отличающийся тем, что хитин после промывки солевым раствором Промывают дистиллированной водой, а десорбцию лизоцимов проводят 3 5о/о-ной уксусной кислотой.