Изобретение относится к области гистохимии, в частности к способам определения внутриклеточной локализации неспецифических экзонуклеаз.
Экзонуклеаза (фосфодиэстраза 1) осуществляет гидролиз поли-, ОЛИГО-, динуклеотидов и динуклеозидофосфатов, вызывая разрыв фосфоднэфирной связи и последовательное отщепление нуклеозид-5-монофосфатов с конца цепи со свооодной 3-гидроксильной группой.
Известен способ определения внутриклеточной локализации экзонуклеазы путем фиксации исследуемого объекта в парах формалина, промывкн Б дистиллированной воде и инкубации в среде, содержащей субстрат, буфер, раствор нитрата свинца и дистиллированную воду.
Однако известный способ недостаточно точен и не дает специфичности индикации.
В предложенном способе в отличие от известного в качестве субстрата в инкубационную среду вносят никотинамидадениндинуклеотид.
И р и м е р. Для определения внутриклеточной локализации экзонуклеазы (фосфодиэстеразы 1) свежеприготовленные и высущепные на воздухе мазки крови и костного мозга крыс фиксируют в парах 10%-ного нейтрального формалина в течение 3 мин и помещают в инкубационную смесь, содержащую 5 мг никотинамидадениндинуклеотида, 0,05 MS змеиного яда, 10 мл (0,2 моль) грис-солянокислого буфера (рН 7,5), 0,125 мл (0,4 моль} раствора нитрата свинца и дистиллированную воду
(до 25 мл).
Мазки инкубируют в термостате при 37°С в течение 3 час, промывают дистиллированной водой и погружают на 2 мин в разведенный сульфид аммония. После промывания мазки
сушат и микроскопируют. Б процессе обработки мазков внутриклеточная экзонуклеаза (фосфодиэстераза 1) вызывает гидролиз никотинамидадениндинуклеотида, содержащегося R инкубационной смеси. Образующийся прн
этом аденозин-5-монофосфат специфически расщепляется нуклеотидазой, являющейся действующим началом диализнрованного и лиофилизированного змеиного яда, и остатки фосфорной кислоты связываются ионами свинца. Полученные соединения затем переводятся в сульфид свинца, который обнаруживается при микроскопировании. Места его отложения отражают локализацию активности экзоиуклеазы (фосфодиэстеразы 1).
Предмет изобретения 3 в парах формалина, промывки в дистиллированной воде, инкубации объекта в среде, содержащей субстрат исследуемого фермента, отличающийся тем, что, с целью повышения 4 специфичности индикации и точности локализации фермента, в качестве субстрата в инкубационную среду вносят никотчнамидадениндинуклеотид.
