В основиом авт. ов. № 223448 описан способ оп ределе1Н«я внутриклеточной лакализаЦ1ИИ р1И5о)Нуклеа:з, заключающийся в TOIM, что объект инкубируют в с:реде, содержащей субстрат исследуемого фермента (.дрожжевую РНК), л И10 фил1ИзирО ва ный и д«авизированный Змеи1ный ял в качестве экзогенной нуклеотидазы и растворимую соль свинца.
Однако такой oniocoi6 недостато-ч;но теней, а время ИНкубации объекта довольно продолжительНО:е. Предла1гаемый onioico:6 отличается от известного тем, что в качастве субстрата И1опользуют цикличеокнй цитидин(2,3)-фосфат.
Это исключает пе|рвый этап гистохимической реакции - разрыв межнуклеотидных фосфадиэфирных связей, со1К|ращает длительность и нкубации объекта,, т ем самьш уменьшая возможность диффузии прамежут очных продуктов, и повышает точность локализации ферментатнвной aiKTiHBHacTH, определяющую ценно.сть гистохиМИчеакого метода.
Для ацределенИЯ внутриклеточной локализация р.ибонуклеаз по предлагаемому спОСобу овежепригоФавленяые и высушенные на воздухе мазки KipoBH и KDCTIHODO мозга крыс фиксируют в парах lOo/0-iBoro нейтрального фюрмалина в течение 10 мин и помешают в инкубаадианиую смесь. Пр .и выявлении щелочной ,зы инкубациавная смесь содержит
5 мг цитидин-(2,3)-фосфата (бариевая соль), 0,05 мг змеиного я:да, 10 мг 0,2М трис-солянокислого буфе|ра (рН 7,5), 0,125 мг 0,4М раствора нитрата свинца и дистиллированную воду (до 25 мл).
При определении К ислой РНК-азы инкубационная смесь содержит 5 мг цитидин-(2.3)фосфата, 0,05 мг змеиного яда, 6,25 мл 0,2М. ацетатиого буфера (рН 5,5), 0,125 мл 0,4М
pa.iCTtBopa нитрата свинца и дистиллированную воду (до 25 мл).
Мазки инкубируют в термостате при 37°С в течение 3 час при (выявлении щелочной
РНК-а вы и 8 час при онредеЛении кислой РНК-Ззы. Затем мазки пр0:мывают дистиллиРованной водой и погружают на 2 мин в разведенный сульфид а 1мания. После промывки мазки сущат и микроскопируют. В процессе
обработки мазков внутриклеточные РНК-азы вызывают гидролиз цитидин-(2,3)-циклофосфата, содержащегося в инкубационной смеси. Образующиеся при этом нуклеозид-3-фосфаты специфически расщепляются нуклеотидаЗОЙ, являющейся действующим началом диа-лизираванного и лиофилизирова нного змеиного яда, и остатки фосфорной кислоты связываются иона.ми свинца. Полученные соединения переводятся в сульфид св1инца, который 3 ста его отложения отражают локализацию рибонуклеазяой ажтивнасти. Предмет из-о б р етев-и я СпОСОб адределения виутриклеточн-ой лока- 5 лизации рибонуклеаз по авт. ов. № 223448, 4 отличающийся тем, что, с целью цовышения точно сти локализации и сои ращения орака инкубации, в качестве субстрата используют цмкличеок-ий Ц1итиии«-(2,3)-фосфат.
