БНЙЛИОТЕКА ^Л. В. Воробьев Советский патент 1972 года по МПК A61K39/00 

Изобретение относится к области медицины, а именно к области иммунологических методов исследования.

Известен способ определения антигена путем обработки (его иммунной сывороткой, меченой флуорохромом. Результат реакции оценивают путем просмотра препарата в люминисцентном микроскопе, в ультрафиолетовых лучах.

Однако известный способ определения антигена не обеспечивает высокой чувствительности реакции н может быть использован только для определения корпускулярных антигенов.

Цель изобретения - увеличение чувствительности реакции и определение корпускулярных .и растворимых антигенов. Это достигается тем, что к сыворотке добавляют меченый флуорохромом гомологичный антиген, комплекс антитело - меченный антиген отделяют от свободного меченого антигена диск-электрофорезом в акриламидном геле, :и результат учитывают по интенсивности свечения меченого антигена при облучении геля ультрафиолетовыми лучами.

Пример. Для испытания чувствительности предлагаемого способа в качестве неизвестного антигена иснользуют традиционный объект иммунологии - альбумин человеческой сыворотки. Это определяет выбор специфической

индикаторной системы. Она состоит из человеческого сывороточного альбумина, меченого изотиоцианатом флуоресцеина и сыворотки, прецииитирующей белок человека. Окрашенный известным способом альбумин фильтруют через колонку с сефадексом G-25, предварительно уравновешенную электродным буфером. Таким образом, одновременно с освобождением альбумина от избытка флуорохрома

(флуоресцеинизотиоцианата натрия) происходит замена физраствора электродным буфером. Элюат собирают в отдельные пробирки порциями по 1,0-1,5 мл. Наиболее ярко окрашенную порцию элюата обозначают как раствор меченого альбумина. Содержание белка в растворе определяемое по Лоури, составляет 4-5 мг/мл.

Затем приготавливают столбики 7%-ного акриламидного геля, используя для мелкопористого геля трис-буфер с рН 7,5, для крупнопористого геля трис-буфер с рП 5,5. В качестве электродного буфера используют трис-верональный буфер с рН 7,0. Приготовив гели и раствор меченого альбумина, приступают к определению его рабочей дозы. Для этого последовательно приготавливают разведения меченого альбумина. 0,05 или 0,1 мл каждого разведения наносят на столбики геля и проводят электрофорез. После

в ультрафиолетовом свете и отмечают последнее разведение антигена, еще дающее четкую светящуюся полосу в «ижней части геля. Это разведение принимают за рабочую дозу меченого антигена.

Затем определяют рабочую дозу гомологичной меченому антигену сыворотки, преципитирующей человеческий альбумин. Смешивают 0,05 мл каждого разведения сыворотки с рабочей дозой меченого альбумина. По 0,1- 0,15 мл смеси наносят на гели и проводят электрофорез.

Комплекс антитело - меченый альбумин в силу большой величины и маленького заряда остается в верхней части геля, в то время как свободный меченый антиген перемещается в его нижнюю часть.

После окончания фореза гели просматривают в ультрафиолетовом свете и отмечают последний гель, где светящаяся полоса находится в верхней части геля. Это и есть рабочая доза сыворотки, т. е. минимальное количество сыворотки, полностью связывающее рабочую дозу меченого антигена.

Далее 0,05 мл раствора определяемого альбумина на электродном буфере смешивают

сначала с рабочей дозой преципитирующей сыворотки, затем добавляют рабочую дозу меченого альбумина. 0,15 мл смеси наносят на гели и после электрофореза учитывают результат реакции по интенсивности свечения свободного и связанного меченого альбумина при облучении геля ультрафиолетовым светом.

Предмет изобретения

Способ определения антигена, основанный на его взаимодействии со специфической гомологичеой сывороткой в реакции иммунофлуоресценции, отличающийся тем, что, с целью увеличения чувствительности реакции и определения корпускулярных и растворимых антигенов, к сыворотке добавляют меченый флуорохромом гомологичный антиген, комплекс антитело - меченый антиген отделяют от свободного меченого антигена дискэлектрофорезом в акриламидном геле, и результат учитывают по иитенсивности свечения связанного и свободного меченого антигена при облучении геля ультрафиолетовыми лучами.