СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИТЕЛ Советский патент 1972 года по МПК A61K39/42 

Изобретение .от1носит1ся к медицине, а, именно к иммужологическим методам иоследования.

Из1весте|н anocoi6 определения а1нтител путем иопользоваиия одного из вариантов непрямого метода люминесцентной микроскопий, согласно которому -фи,ксир|0ванный в мазке .ио рпускулярный антиген oi6ipai6aTbiваю,т иопыту-емыми а-нтит.ела.ми, а затем флуоресцирующей антиглобулиновой iCbiBOрогкой. Известный способ не обеапечивает чувствительности р,еа,к11,ии при Облучении акр.иламидного геля ультрафиолетовым светом.

Цель иЗ|О5рет0ния - увеличение чувствительности реакции и определение антител как к корпускулярным, так и к растворимым антигенаМ - достигается тем, что спецИ|фический антиген метят флу0рохром1ом, комплекс антитело-меченый антиген отделяют от свободного меченого антигена диок-электрофог резом в .акриламидном геле ,и результат учитывают по интенсивности свечения свободного и связанного антигена..

Пример. Для испытания чувст1вительности используют традиционный объект иммунологии - альбумин человеческой icwBOРотки. Окрашенный известным способом альбу|Мин фильтруют через .колонку с |сефадвксОМ, предварительно уравн101вешенную электродным буфером. Одновремен.н.о с освобождением альбумина от избытка флуорохром.а (флуоресцеина ивотиацианата натрия) происхо.дит замена физраствора электродным буфером. Элюат собирают в отдельные пробирки порциями по 1-1,5 мл. Наиболее ярко окрашенную порцию .элюата обозначают, как раствор меченого альбумина. Содержание белка в растворе, определяемое по Лоури, соста.вляет 4-5 мг/мл.

Приготовляют столбики 7%-.ного акриламидного геля, используя для .м.ел капористого геля трис-|буфер с рН 7,5, а для кру1пнооористого теля трис-буфер с рН 5,5. В качестве электродного буфера используют трис-вероналовый буфер с рН 7,0. .Приготовив гели и раствор меченого альбумина, приступают к определению его рабочей дозы. Для этого приготовляют последовательные

разделения меченого альбумина. 0,05 или 0,1 мл каждого разведения наносят на столбики геля в проводят электрофорез. После окончания электрофореза гели просматривают в ультрафиолетовом свете и отмечают

ггО|Следнее развед.е.ние антигена, дающее четкую светящуюся полосу в .нижней части геля. Это раз.ведение принимают за ра1бОчую дозу меченого антигена. Пригота.вливают последовательные развебочей дозой меченого альбумина. По 0,1 - 0,15 мл смеси наносят на гели и проводят аЛекгрофорез. При наличии в сыворотке антител они соединяются с меченым антигеном. Комплекс айтитела-меченЫй антиген в силу своей большой вели.чины и маленького заряда остается в верхней части геля, а свободный меченый антиген быстро, перемещается в нижнюю часть геля. После окончания фореза гели 1прО1СМ,атривают .в ультрафиолетово.м свете и огпмечают последний гель, где светящаяся полоса находится в верхней части. Это и 1будет наи большее, раэведение сыворотки, связывающее рабОЧую дозу меченого антигена, т. е. ее цитр. Предмет изобретения Способ определения антител путем Взаимодейст.ВИя со апецифическим .антигеном с последующим просмотром препарата в у|льТ1рафиолетовых лучах, отличающийся тем, что, с целью увеличения чувствителья-асти и возможнорти применения .метода для определения антифел как к корпускулярным, так и растворимым антигенам, .апецифичаокий антиген метят флуорохромОМ, комплекс антителомеченый антиген отделяют от свободного меченого антигена диск -электрофорезом в акриламидном геле и результат учитывают по интансивиости свечения свободного к связанного антигена,