СПОСОБ ПОСТАНОВКИ РЕАКЦИИ ИММУНОФЛУОРЕСЦЕНЦИИ Советский патент 1994 года по МПК A61K39/00 A61B10/00 

Изобретение относится к медицине, в частности к иммунологии, и может быть использовано для улучшения качества иммунофлуоресцентного анализа поверхностных антигенов различных клеток в диагностике особоопасных и других инфекционных заболеваний.

Целью изобретения является повышение специфичности реакции иммунофлуоресценции.

Способ осуществляется следующим образом.

Взвесь исследуемых (лимфоидных или бактериальных) клеток окрашивают люминесцирующей антисывороткой, затем проводят свободный непрерывный распределительный электрофорез этих клеток. Используют люминесцирующую ослиную сыворотку против иммуноглобулинов кролика для выявления поверхностных иммуноглобулинов на B-лимфоцитах. Одним из контролей на специфичность таких сывороток является отрицательная реакция с выделенными из тимуса Т-лимфоцитами, на которых отсутствуют поверхностные иммуноглобулины. Из тимуса кроликов выделяют лимфоциты и готовят их суспензию в среде Хенкса. Лимфоциты обрабатывают люминесцирующей антисывороткой против иммуноглобулинов и разделяют на две части. Из одной части готовят мазки, промывают в 3-4 порциях забуференного физиологического раствора (а также дистиллированной водой в течение 15 мин) и просматривают под люминесцентным микроскопом. Суспензию лимфоцитов из этой же части трижды отмывают центрифугированием и исследуют на проточном цитофлуориметре. Результаты исследования приведены в табл. 1.

Из данных табл. 1 видно, что в среднем 9,67% клеток имели свечение на +++ и ++++ при исследовании на мазках под микроскопом и 57,95% клеток метились флуорохромом при Сорбит - 246,42 мМ Глюкоза - 38,50 мМ NaOH - 5,33 мМ Трис - 11,71 мМ NaCl - 3,71 мМ и подвергают свободному распределительному элекрофорезу на аппарате исследовании в суспензии на проточном цитофлуориметре.

Вторую часть лимфоцитов, не отмывая от сыворотки, подвергают непрерывному свободному распределительному элекрофорезу на аппарате Elphor V_apV. При этом лимфоциты распределяются в 13-14 отдельных фракциях, которые потом объединяют, а клетки осаждают центрифугированием. Осадок ресуспензируют в растворе Хенкса и просматривают под люминесцентным микроскопом, а также исследуют в проточном цитофлюориметре. Результаты исследования приведены в табл. 2.

Из таблицы видно, что прохождение клеток в электрическом поле в процессе непрерывного свободного распределительного электрофореза практически полностью устраняет неспецифическое окрашивание Т-клеток люминесцирующей антисывороткой и иммуноглобулинами.

Таким образом, неспецифически сорбированные на тимоцитах антитела и свободный флуорохром, обладая электрическим зарядом, отличным от заряда лимфоцитов, оказавшись в электрическом поле, отделяются от лимфоцитов.

Способ поясняется следующими примерами.

П р и м е р 1. Определение количества B-лимфоцитов (несущих поверхностные иммуноглобулины) в суспензии лимфоцитов, выделенных из периферической крови кролика.

Из крови кролика выделяют лимфоциты с помощью центрифугирования в градиенте плотности верографина. Окрашивают люминесцирующей ослиной сывороткой против иммуноглобулинов кролика в рабочем разведении, смесь инкубируют 30 при -4^оС в присутствии 0,02% азида натрия. Лимфоциты разводят разделительным буфером до концентрации 7-10 млн/мл следующего состава: KCl - 1,20 мМ CaCl₂ - 0,61 мМ MgSO₄ - 0,32 мМ K₂HPO₄ - 0,003 мМ pH - 7,00 Elphor V_apV со стандартными параметрами (напряжение 850 В, V клеток - 2 мл/ч, V буфера - 500 мл/ч, t - 4^оС). Клетки в результате электрофоретической сортировки выходят в 14 отдельных фракциях - пробирках коллектора (см. табл. 3).
Из табл. 3 видно, что пробы, соответствующие Т-клеткам (первые фракции, характеризующиеся высокой электрофоретической подвижностью) практически не содержат лимфоцитов, несущих поверхностные иммуноглобулины, а пробы, соответствующие B-клеткам (последние фракции с низкой электрофоретической подвижностью) содержат основную массу лимфоцитов, меченных антисывороткой против иммуноглобулинов, т. е. определяются как B-лимфоциты.

Таким образом, прохождение обработанных антисывороткой лимфоцитов в электрическом поле обеспечивало удаление с этих клеток неспецифически сорбированных люминесцирующих антител и свободного флуорохрома.

П р и м е р 2 (см. табл. 4). Электрофорез позволяет уменьшить число клеток с уровнем неспецифического свечения на (+), (2+) до 6,27 ± 1,13% , т. е. в 3,26 раза по сравнению с прототипом, а также число клеток с уровнем свечения на 3+, 4+ до 0,40 ± 0,12% , т. е. в 19,8 раз по сравнению с использованием альбумина, меченного родамином.

Таким образом, способ позволяет удалить неспецифически сорбированные люминесцирующие антитела и свободный флуорохром с лимфоидных клеток, уменьшает неспецифическое свечение этих клеток в 19,8 раз по сравнению с использованием родамин-альбумина, и в 3,5 раза снижает неспецифические реакции близкородственных микроорганизмов (с 696 ± 228 до 197 ± 24) удалением неспецифических сорбированных антител и свободного флуорохрома и оценкой реакции в люминесцентном микроскопе. (56) Наставление по применению сухого альбумина, меченного родамином МЗ СССР, 31. XI. 71.

СПОСОБ ПОСТАНОВКИ РЕАКЦИИ ИММУНОФЛУОРЕСЦЕНЦИИ путем коньюгации бактериальных и лимфоидных клеток с люминесцирующими сыворотками с последующим удалением неспецифических сорбированных антител и свободного флуорохрома и оценкой в люминесцентном микроскопе, отличающийся тем, что, с целью повышения специфичности реакции для удаления неспецифически сорбированных антител и свободного флуорохрома, коньюгат подвергают действию электрического поля методом свободного непрерывного распределительного клеточного электрофореза.