Способ получения гибридного полипептида, содержащего НВ @ А @ Советский патент 1992 года по МПК C12N15/51 C12N15/30 

Изобретение относится к генетической инженерии, в частности к получению бифункциональных антигенов, клонированию генов, которые кодируют эти антигены в дрожжах.

Известен способ приготовления гибридного полипептида HBsAg-Herpes симплекс I вирус гликопротеин Д (HSV-lgD) при экспрессии последовательности, кодирующей гибрид HSV-lgD-Pre S2-S белок, в дрожжах.

Наиболее близким к изобретению является способ получения гибридного полипептида, содержащего HBsAg, заключающийся в том, что осуществляют конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК, кодирующей слитый полипептид, трансформацию полученными ДНК штаммов Saccharomyces, cerevlsfae, выделение и очистку целевого продукта.

Способ заключается в том. что 64 кодо- на ДНК последовательности, кодирующей повтсфяющийся эпитоп циркумсиорозоитного белка (CS) Plasmodlum falclparum и восемь кодонов CS кодирующей последовательности Pre S2 белка встраивают в вектор, экспрессирующийся в дрожжах, причем он состоит из репликона или последовательности Pre S2-S белка и соответствующей регу- ляторной области. Оба вектора экспрессии, а именно один, содержащий последовательность из 64 кодонов, и другой, содержащий CS последовательность из 8 кодонов, каждый трансформируют в клетки дрожжей-реципиентов и анализируют экстракты таких трансформированных клеток на наличие HBsAg эпитопов и CS эпитопов на той же молекуле.

Новые последовательности, кодирующие Pre S2 и Pre S2-S белок HBV, получают из adW субтипа HBV. который был выделен из плазмиды pRIT10616. Последовательности, кодирующие Pre S2-S белок, извлекают с помощью традиционных процедур рекомбинантной ДН К из плазмиды pRIT 10616. Pre S2 область последовательностей характери

Ё

V4 4 О 00 00 Ч

GJ

зуется следующей аминокислотной последовательностью: 5О

Met Gln-Trp-Asn-Ser-Thr-Ala-Phe- HIs-Gln-Ala-Leu-Gln-Asp-Pro-Arg-Val-A rg-GJy-Leu-Tyr-Phe-Pro-Ala-Gly-Gly-Ser -Ser-Ser-Gly-Thr-Val-Asn-Pro-Ala-Prff Asn-tle-Ala-Ser-Hls-lle-Ser-Ser-Ser-Ser - Ala -Arg-Thr-Gly-Asp-Pro-Val-Thr-Asn.

Функциональным производным Рге S2-S согласно предлагаемому способу является производное, у которого аминокислота аланин (GCT) в положении 45 модифицирована с помощью сайт-специфического мутагенеза на треонин (ACT).

Рекомбинантная плазмидная ДНК состоит из последовательности, кодирующей Рге S2 и Рге S2-S белок, лигированной с регуляторной областью.

П р и м е р 1. Конструкция плазмиды PRIT10167.

В качестве исходного материала используют плазмиду рбу, содержащую фрагмент 2.1 Kb Hldn III дрожжевой ДНК, кодирующий ген TD НЗ, клонированный на pBR 322. Фрагмент Hind III дрожжевой ДНК клонируют в pBR 322, в которой сайт EcoR I разрушают и получают pRIT10164.

ДНК pRIT10164 очищают путем центрифугирования в градиенте CS СI-эти л бромид. 150 мкг pRIT10164 ДНК обрабатывают 75 единицами эндонуклеазы Xbal, экстрагируют фенолом и эфиром, осаждают этанолом в ДНК, ресуспендируют в 0,01 М трометамин-НС1-буфере при концентрации 1 мкг/мкл| 20 мкг ДНК, обработанной Xbat, гидролизуют Ва131 для удаления 61 п.о. ДНК между ATG кодоном и сайтом Xbal. Обработку Ва131 осуществляют при 30°С в течение 1-3 мин в буфере, содержащем 600 ммоль хлористого натрия, 12 ммоль хлористого кальция, 12 ммоль хлористого магния, 1 ммоль этилендиаминтетрауксусной кислоты (ED ТА), 20 ммоль трометамин-HCI, рН 3,1 с использованием одной единицы нукле- азы Ва131 на 20 мкг ДНК в конечном реакционном обьеме 200 мкл.

Реакцию останавливают путем добавления этилен-бис(оксиэтиленэмтрило)тет- рауксусной кислоты (EGTA) с получением конечной концентрации 20 ммоль и образцы экстрагируют эквимолярными объемами фенола, эфира и осаждают этанолом. Каждый образец ДНК ресуспендируют в 20,мкл 10 мМ буфера трометамин-HCI, рН 7,5.

Степень гидролиза Ва131 измеряют путем обработки 2,5 мкг образца ДНК эндо- нуклеазой Hpal и путем сравнения размера фрагмента Hpal-Xbal с фрагментом 335 Ьр Hpal-Xbal из pR T10164, Двухминутный гидролиз Ва131 удаляет 41-88 нуклеотидов из фрагмента Xbal-Hpal плазмиды pRIT10164. 5 мкг ДНК обрабатывают эндонуклеа- эой BamHI, проводят экстракцию фенолом

и осаждение этанолом. Эту ДНК обрабатывают 5 единицами. Т4 полимеразы в присутствии дезоксинуклеотида трифосфатов для того, чтобы заполнить BamHI и Ва131 концы, экстрагируют фенолом и извлекают

0 осаждением этанолом. 2,3 мкг этой ДНК обрабатывают 5 ед. Т4 ДНКлигазы и половину сшитой ДНК используют для трансформации компетентных клеток E.coll K12 штамма ММ294. 1 мл трансформированной популя5 ции E.coll разбавляют в 350 мл L-бульона с 200 мкг/мл ампициллина и общую плазмиду ДНК очищают из полученной культуры.

80 мкг этой плазмиды ДНК обрабатывают 75 ед. Hind III эндонуклеазы и 96 ед.

0 BamHI эндонуклеазы.

Целевые фрагменты Hind lll-BamHI, соответствующие размерам 1100-1000 Ьр, на препаративном 1 %-ном агарозном геле выделяют из геля в два среза, причем один

5 соответствует ДНК с размером около 1070 Ьр, другой -1030 Ьр. ДНК извлекают из двух агарозных гелевых срезов с помощью циклов замораживания и оттаивания, после чего проводят центрифугирование агарозы с

0 высокой скоростью. Верхний слой жидкости отфильтровывают с помощью фильтров и ДНК извлекают с помощью двух циклов эта- нольного осаждения и ресуспендирования в 20 мкл 0,01 М трометамин-HCI буфера с рН

5 7,5.

Анализ агарозного геля электрофорезом и сравнение гидролизованной Hind III- Xbal плазмиды pRIT10l64 ДНК и с фрагментами из Hind III EcoRI фага АДНК

0 показывает, что получают два различных фрагмента Hind lll-BamHI, один размером 1070 Ьр, а другой размером около 1030 Ьр, в сравнении с 1120 bp Hind Ill-Xbal фрагментом плазмиды pRIT10164. Около 100 нг

5 фрагмента 1030 bp Hind lll-BamHI лигируют с 200 нг плазмиды pl)C9, которую обрабатывают Hind III и BamHI эндонуклеазами и щелочной фосфатазой. Полученную ДНК используют для трансформации клеток E.coli

0 штамма J М103 с селекцией на устойчивость к ампициллину.

Получают около 400 устойчивых к ампициллину колоний на 1 мл и 98 колоний и испытывают в среде, содержащей X-gal.

5 Плазмиды из трансформированных колоний получают после амиплификации плазмид путем добавления спектиномици- на (150 мкг/мл) к растущим культурам.

Рекомбинантные плазмиды анализируют на 7,5%-ной акриламидном геле после

гидролиза с AVall и BamHI эндонуклеазами и сравнивают с 450 Ьр фрагментом AVall- Xbal, включающим промотор-Ы-концевую кодирующую область pRIT10164, и с Hpall фрагментом ДНК плазмиды pBR322. AVall- BanrfHI фрагмент присутствует в 35 из 36 плазмид. Три плазмиды выбирают для дальнейших исследований. Плазмидную ДНК выделяют путем центрифугирования в градиенте плотности CSCl-этилбромид и 25 мкг ДНК гидролизуют EcoRI. EcoRI концы метят у-Р-АТР.

П р и м е р 2. Конструкция векторной PRIT10172.

1050 Ьр Hind lll-BamHI TDH3 ДНК вставки из pRIT10167 клонируют на челночном векторе YEp13 и получают рекомбинан- тную плазмиду pRIT12059.

ДНК плазмиды pRIT12159 гидролизуют Xbal и BamHI эндонуклеазами и фрагмент 1650 Ьр лигируют с фрагментом Xbal- BamHI, содержащим стимулятор arg на плазмиде pRIT10774. Плазмида pRIT10774 включает репликон YEp13, из которого удалены сайты BamHI и Xhol путем манипуляции in vitro с фрагментом 1470 ba Hind lll-BamHI, включающим область стимулятора arg3, и фрагментом 1150 bp BamHI-Hind ill, включающим arg3 область окончания транскрипции. Замена стимулятора arg на pRIT10774 на стимулятор TDH3 дает плазмиду pRIT10172, которая содержит единственный сайт BamHI, расположенный при кодоне АТС стимулятора TDH3 и предшествует сигналу окончания транскрипции на 1150 bp BamHI-Hind III arg3 ДНК фрагменте. Чужеродную ДНК можно клонировать в этом сайте.

П р и м е р 3. Фрагмент 1050 bp Hind IM-EcoRI из pRIT10167 и Hind lll-BamHI TDH3 фрагмент, содержащий стимулятор, вместе с частью BamHI-Smal-EcoRI полилинкера pUC9 клонируют между сайтами Hind III и EcoRI плазмиды pBR322, в которой предварительно удаляют сайт BamHI путем заполнения полимеразой Т4 ДНК и лигируют,

Плазмидную ДН К pRIT 10158 обрабатывают эндонуклеазой EcoRI и полимеразой Т4 ДНК для заполнения EcoRI-концов. Этот препарат обрабатывают эндонуклеазой Clal. ДНК pRIT10158 гидролизуют эндонуклеазами Clal и Hallll и фрагмент 1150 Ьр Cla-Ha l)l. несущий область окончания транскрипции arg гена, извлекают путем препаративного электрофореза на агароз- ном геле и электроэлюированием. Этот фрагмент лигируют с ДНК плазмиды PRIT10158. обработанной EcoRI, T4 ДНК полимеразой, Clal, и лигированную смесь

используют для трансформации клеток E.coll штамма ММ294. Из трансформированных колоний выделяют плазмиду, в которой фрагмент Clal-Haelll окончания 5 транскрипции arg3 вставлен между сайтами Clal, сайт EcoRI заполнен и восстановлен. Плазмидную ДНК pRIT10162 обрабатывают EcoRI и Pst эндонуклеазами. смесь лигируют и используют для трансформации клеток

0 E.coli K12 штамма ММ294. Извлекают плазмиду pRIT 12208, в которой большой фрагмент 4630 Ьр EcoRI-Pst I из pRIT12176 лигируют с фрагментом 1930 bp EcoRI-Pst I из pRIT10162, в котором arg3 область окон5 чания сшивается со стимулятором TDH3, Фрагмент 2200 bp Hind 111 из pRIT12208 клонируют в сайт Hind III производной плазмиды pBR322, в которой сайты EcoRI и BamHI удаляют путем заполнения полиме0 разой Т4 ДНК и лигированием. В обеих плазмидах pRIT12208 и pRIT12290 фрагменты стимулятора TDH3 и arg окончания транскрипции разделены сайтами BamHI, Smal и EcoRI, и области стимулятора и окон5 чания транскрипции могут быть вырезаны вместе на фрагменте 2200 bp Hind IK.

Сайт BamHI полезен для клонирования, так как он расположен при АТС кодоне гена TDH3 и может быть применен для слияния

0 других генов со стимулятором TDH3.

П р и м е р 4. Конструкция плазмид pRIT10677, pRIT10909 и pRIT10158. a)pRIT10677. BamHI фрагмент 1372 bp клонирован5 ной HBsAg ДНК вырезают из pRIT10616 и лигируют с вектором PBR327. обработанным эндонуклеазой BamHI. Этот фрагмент BamHI содержит часть области предшественника HBsAg. Получают плазмиду

0 pRIT10677, которая имеет BamHI фрагмент HBV, вставленный в сайте BamHI вектора в такой ориентации, что сайт Xbal в HBV ДНК расположен близко к сайту Sail вектора PBR327.

5в) pRITT0909.

Hind ill фрагмент 3300 bp из плаэмиды рМС200 клонируют в производную плазмиды pBR322, в которой EcoRI сайт удаляют путем заполнения полимеразой Т4 ДНК, и

0 повторным лигированием отбирают плазмиду pRIT10158, в которой Hind III имеет 3 область arg3 гена. Фрагмент 1150 bp Clal- Haelll извлекают из pRIT10158, он содержит окончания транскрипции гена arg . Этот

5 фрагмент 1150 Ьр лигируют с Clal-Hpal фрагментом ДНК плазмиды pRIT10677. Получают плазмиду pRIT10909.

П р и м е р 5. Сайт BamHI pRIT10167 (пример 1), расположенный в области предшественника HBs Ag гена, из HBV вируса

adW серотипа, клонированного на pRIT10616, находится в одинаковой трансляционной рамке считывания. Источником HBV ДНК фрагмента является плазмида PRIT10909. Фрагмент 2085 bp EcoRI-BamHI выделяют из pRIT10909 и встраивают в сайт EcoRI и BamHI плазмиды pRIT10909 и получают плазмиду pRIT10911. Фрагмент 3134 bp Hind III из pRIT10911, содержащий сигналы транскрипции дрожжевой ДНК и ДНК HBsAg, встраивают в челночный вектор YEp13 с получением плазмиды pRIT10912.

Примерб. Сконструированы плазмиды, у которых удалены избыточные нуклео- тиды изб1 конца фрагмента ДНК, кодирующего N-терминальную часть приходной HBsAg. 1225 bp FnUD II фрагмент HBV ДНК из pRIT10616 и кодирующий HBsAg ген вырезают из этой плазмиды и лигируют с EcoRI, фрагмент клонируют в EcoRI сайт вектора pACYC184 с получением pRIT10679. Получают 125 bp EcoRI-Xbal фрагмент, который содержит терминальную область HBsAg предшественника. HBsAg ATG кодон и 90 bp -HBsAg кодирующую последовательность, Этот 125 bp EcoRI-Xbal фрагмент встраива- ют в сайты EcoRI и Xbal pRIT 10158. Полученная , плазмида pRIT 10903 содержит единственный 1 сайт EcoRI, расположенный при стыке между arg ДНК и HBV ДНК и единственный сайт Xhd, расположенный в области стимулятора.

150 мкг pRIT10903 плазмидной ДНК. которую получают с помощью центрифугирования в градиенте плотности CsCI этиленбромида, обрабатывают 80 ед. эндо- нуклеазы EcoRI, после чего экстрагируют фенолом, осаждают этанолом и вновь суспендируют при концентрации 1 мкгна 1 мкл в 10 мМ буфере трометамин-HCI (рН 7,5). ДНК разделяют на три образца по 50 мкг и инкубируют в течение 50, 75 и 90 с с нукле- азой Ва131 при 30°С. К 50 мкг EcoRI обработанной pRIT10903 ДНК, добавляют 2,5 ед. нуклеазы Ва131 в конечном объеме из 500 мкл. Реакцию останавливают путем добавления EGTA к 20 мМ конечной концентрации, охлаждают на льду, экстрагируют эквивалентным объемом фенола и осаждают этанолом. Образцы ДНК, обработанные Ва131, берут в 50 мкл 10 мМ буфера трометамин-HCI и 2,5 мкг дополнительно обрабатывают эндонуклеазой Bst Ell, выделяют 285 bp фрагмент нуклеазой в течение 75 с при 30°С, уменьшает размер фрагмента.Есо RI-Bst Ell на 10-60 основных пар. Удаление на 29 основных пар из Fnud II сайта удаляют весь HBsAg предшественник ДНК и HBsAg ATG кодон.

5 мкг pRIT10903 ДНК обрабатывают в течение 75 с Ва131, гидролизуют 8 ед. Xhol

нуклеазы, экстрагируют фенолом и осаждают этанолом. Эту ДНК затем инкубируют с 5 ед. Т4 ДНК полимеразы в присутствии диоксинуклеотидтрифосфата для заполнения сайтов Xbal и Ва131, обрабатывают фенолом и осаждают этанолом. Затем ДНК инкубируют с 5 ед. Т4 ДНК лигазы в течение 16ч при 16°С и смесь используют для трансформации компетентных клеток E.coll K12

штамма ММ294. Около 2000 колоний, устойчивых к ампициллину, на 1 мл извлекают после посева, выделяют плазмиды из 47 индивидуальных колоний.

Одну плазмиду, содержащую фрагмент

Xhol-Xbal размером 95-100 основных пар. выбирают для исследований. ДНК этой плазмиды очищают с помощью центрифугирования с градиентом плотности CSCI-эти- ленбромид и 25 мкг такой ДНК гидролизуют

140 ед. эндонуклеазы Xbal.

Концы Xbal метят у-32Р-АТР и меченую ДНК обрабатывают 15 ед. эндонуклеазы Hind III. Фрагмент 765 bp Hind III - Xbal изолируют акриламидным гелевым электрофорезом и электроэлюированием. после чего осаждают этанолом. Нуклеотидную последовательность вокруг сайта Xhol определяют последовательным анализом этого фрагмента от меченого конца Xbal. Данные

о последовательности показывают, что сайт Xhol расположен на первой основе второго кодона HBsAg кодирующей последовательности:Xhol.

CTCGAGAAC.

HBsAg нуклеотидов. П р и м е р 7. Плазмиду pRIT10911 используют в качестве носителя для дальнейших манипуляций. Плазмиду гидролизуют

эндонуклеазами BamHI и Xbal, и этот фрагмент замещают на фрагмент 2275BamHI- Xbal из плазмиды pRIT10158 Получают плазмиду pRIT12J-11.

Плазмиду pRIT12211 обрабатывают эндонуклеазами Xhol и Xbal, и удаляют фрагмент 1600 bp Этот 94 bp фрагмент очищают акриламидным гелевым электрофорезом, электроэлюируют соответствующий геле- вый срез и извлекают ДНК этанолом для

осаждения.

Плазмиду pRIT12209 очищают центрифугированием с градиентом плотности смеси CS Cl-этилбромид и 50 мкг pRIT12209 ДНК гидролизуют с 90 ед эндонуклеазы BamHI и 60 ед. Xhol эндонуклеазы для удаления 990 bp периферической ДНК между стимулятором TDH3 и HBsAg кодирующей областью и затем экстрагируют фенолом и осаждают этанолом 16 мкг этой ДНК инкубируют в течение 30 мин при 30°С с 20 ед Мунг Бин нуклеазы в объеме 125 мкл.

Буфер, используемый для инкубирования, представляет собой 30 ммоль ацетата натрия (рН 4,6), 250 ммоль хлористого натрия, 1 ммоль хлористого цинка и 5% глицерина. Реакцию останавливают добавлением додецилсульфата натрия с получением 0,2%-ной конечной концентрации, проводят экстрагирование эквивалентным объемом фенола, после чего осаждают этанолом. Аликвоту 0,5 мкг этого образца инкубируют 2 ед. Т4 ДНК лигазы в течение 16ч при 16°С и затем проводят обработку 2 ед эндонук- леазы Bam HI для разрушения каких-либо векторных молекул. Эту смесь используют для трансформации клеток E.coll K12 штамма ММ294. извлекают около 2000 устойчивых к ампициллину колоний.

Четыре плазмиды берут для дальнейшего исследования. ДНК каждой плазмиды переваривают Xbal эндонуклеазой и метят у-32Р-АТР, после чего гидролизуют эндонук- леазами Hind III и выделяют меченый 1190 Ьр фрагмент Hind Ill-Xbal с помощью элек- троэлюирования и этанольного осаждения с последующим акриламидным гелевым электрофорезом. Последовательность каждого фра мзнта определяют методами химической модификации Максама и Гильберта. Две плазмиды имеют точную последовательность ATGGAG ААС для полного слияния области стимулятора TDH3 с HBsAg геном. Одную из этих плаэмид (pRIT12230) используют в дальнейших манипуляциях. ДНК этой плазмиды (pRIT122 30) гидролизуют эндо- нуклеазами Hind III и 300 Ьр фрагмент, содержащий HBsAg кодирующую последовательность, слитую с TDH3 стимулятором, лигируют с челночным вектором YEp13. Полученной плазмидой pRIT12265 трансформируют дрожжевой штамм DC5 (МАТа, leu 2-3, leu 2-112, his 3, can 1-11).

П р и м е р 8. 25 мкг ДНК pRIT12230 гидролизуют с эндонуклеазами Accl и EcoRI. pRIT12230 содержит единичный сайт Accl. расположенный в S-ген кодирующей последовательности за 7 нуклеотидами перед ТАА стоп-кодона. Проводят электрофорез гидролизацией ДНК на 1%-ном агарозном геле и извлекают векторный фрагмент 4200 Ьр из геля с помощью электроэлюирования и этанольного осаждения. Молекулы, связывающие искусственную ДНК, составленные из 12-членного (12-mer) витка и 14-членного (14-гпег) линкера со следующими последовательностями синтезируют для вставки между Accl и EcoRI центрами pRIT12330:

5 ATACATTAAGG 3

12 тег.

3 TGTAAATTGCTTAA5 , 14 тег.

100 пмоль синтетического 12 тег и 100 пмоль синтетического 14 тег линкера сме- 5 шивают вместе в конечном объеме 10-20 мкл. нагревают при 70°С в течение 15 мин. медленно возвращают к комнатной температуре в течение 3 ч и обеспечивают обжиг двух витков вместе с их комплементарными 0 последовательностями. К этой отожженной смеси добавляют 0,15 пмоль (400 нг)4200 Ьр Accl-EccRI фрагмента pRIT12230 10-кратно концентрированного буфера для лигирова- ния if 2 ед. Т4 ДНК лигазы.

5 Эту смесь инкубируют в течение 4 ч при 16°С перед добавлением дополнительных 2 ед. Т4 ДНК лигазы и затем инкубируют в течение ночи на льду. Смесь после лигиро- вания используют для трансформации ком0 летентных клеток штамма ММ294. Выделяют плазмиды из 12 или более индивидуальных колоний.

Плазмиду со вставкой Accl-EcoRI гидролизуют эндонуклеазами EcoRI и обрабаты5 вают щелочной фосфатазой. Фрагмент 2650 Ьр Hind III pRIT10162 клонируют в сайте Hind III pBR327 векторной плазмиды, получают плазмиду pRIT12288.

Из pRIT12288 получают Фрагмент 1180

0 bp EcoRI. который несет arg транскрипционную терминационную область. Этот фрагмент клонируют в сайт EcoRI производной pRIT 12230, которую обрабатывают щелочной фосфатазой.

5 Выделяют 2900 bp Hind Ill-фрагмент из PRIT12322.

П р и м е р 9. Плазмида pRIT12322 содержит 2900 bp Hind III фрагмент.со всеми необходимыми сигналами для экспрессии

0 HBsAg из TDH3 стимулятора. Этот фрагмент лигируют с челночным вектором для введения в клетки дрожжей.

ДНК челночного вектора YEp13 обрабатывают эндонуклеазой Hind III и щелочной

5 фосфатазой и используют в качестве реципиента для введения Hind III фрагмента из pRITt2322. Получают плазмиду pRIT12329, которая состоит из репликона YEp13 вместе с 2900 bp Hind III модульным фрагментом.

0 П рим ер 10. Плазмиду WP201 получают в результате введения EcoRI фрагмента из AmPfl в вектор pUC8. Фрагмент плазмиды WR201, содержащий CS белковую кодирующую последовательность минус первый

5 52 Ьр, очищают электроэлюированием из 7,5%-ного полиакриламидного электрофо- ретического геля. Этот фрагмент обрабатывают Sau ЗА. ВатН плазмиды pRIT10911, расположенный при ATG кодоне инициации, находится в фазе с sau ЗА сайтами С5

Plasmodlum falciparum. ДНК плазмиды pRIT10911 обрабатывают с BamHI эндонук- леазами, щелочной фосфатазой, экстагиру- ют фенолом и извлекают осаждением этанолом. 0,2 мкг этой ДНК смешивают с 0.2 мкг Sau ЗА обработанного Stu l-RSal CS гена, обрабатывают Т4 ДНК лигазой, илиги- рованную смесь используют для трансформации компетентных клеток E.coll K12 штамма ММ294. Получают 32 плазмиды из индивидуальных трансформантных колоний после амплификации плазмиды путем добавления спектиномицина (300 мкг на 1 мл) для выращивания культуры. Рекомби- нантные плазмиды анализируют на 7,5%- ном акриламидном злектрофоретическом геле, после гидролиза с эндонуклеазами BamHInXbal.

Hind III фрагменты pRIT12572 и pRIT12571, содержащие стимулятор TD НЗ, CS-HBsAg гибридную кодирующую последовательность и arg3 область терминации, вновь клонируют в YEp13 и получают плаз- миду pRIT12574 и pRIT12573.

Плазмиды pRIT10912, pRIT 12574 и pRIT12573 вводят в S.cerevlslae дрожжевой штамм ДС-5 (a, leu 2-3, leu 2-112, his 3, Can ) и в S.cerevlsiae дрожжевой штамм 10 S 44C (pep 4-3, leu 2-3, leu 2-112) трансформацией клеток, обработанных ацетатом лития.

Плазмидную ДНК pRIT12572 или pRIT12571 гидролизуют BamHI эндонуклеа- зой и обрабатывают щелочной фосфатазой. 1215 bp Stul-RSal фрагмент плазмиды WR201 обрабатывают Sau ЗА эндонуклеа- зой и вы деля ют 192 Ьр и 24 Ьр фрагмент. Эти фрагменты смешивают с pRIT12572 или pRIT12571 векторами, которые предварительно обработаны BamHI, щелочной фосфатазой и ТН ДНК лигазой, трансформируют клетки E.coli K12. Проводят скриннинг плазмид из трансформантных колоний. Наличие BamHI сайта на таких плазмидах подтверждает введение 192 Ьр или 24 bp Sau ЗА фрагмента в точной ориентации для слияния при АТС кодоке.

Плазмида pRIT12309 состоит из Ьр 2 микронной ДНК последовательности из дрожжей, клонированных в EcoRI сайте плазмидного вектора pBR327, 6318 bp 2 микронную ДНК последовательность получают из плазмиды рС V19.

2850 bp Clal-Sall фрагмент, содержащий TD НЗ-arg3 и расположенные сТюку последовательности pBR322 из pR|T12290. клонируют в векторе pRIT12309 между сайтами Cla а и Sail, Полученную плазмиду pRIT12314 гидролизуют с Sail эндонуклеа- зойи лигируютс2218 bp Sall-Xhol фрагментом из YEp13, содержащего дрожжевой Leu 2 ген.

Плазмиду pRIT12544 получают из колоний, в которых плазмидную ДНК содержит

2218 bp Sal l-Xhol фрагмент с leu 2 геном, который введен в сайт Sal).

3328 bp Hind III фрагмент pRIT12574, a также ДНК YEp13 клонируют на pBR322 ABamHI плазмиде и получают pRIT126Q8.

0 2550 bp BamHI-Sall фрагмент из pRIT12608, содержащий CS HBsAg, arg3 область терминации транскрипции pBR322 последовательность, клонируют между BamHI и Sail сайтами pRIT12544 и получают

5 плазмиды pRIT12658.

П р и м е р 11. Трансформируют дрожжевые (Saccharomyces cerevisiae) штаммы DCS и 10 S 44C каждой из плазмид PRIT10912, pRIT12573, pRIT12574 или

0 pRIT12659, или плазмид pRIT12329,

pRIT10172 и выращивают в жидкой среде с

недостатком лейцина (VNB или VNB + 80

мкг/мл гистидина) с последующим сбором

. культуры в средней лог-фазе. Клетки в куль5 туре 1 или 2 мл отбирают путем центрифугирования и суспендируют в 50 мкл 0,125 М трис-HCI (рН 6,8), содержащих 20% глицерина, 4% SDS, 6 М мочевины и 10% 2-мер- каптоэтанола. Пос/;е инкубирования в

0 течение 5 мин при 100°С образец делят пополам и обе половинки подвергают электрофорезу через 12,5% разделяющий гель, 5% слоистый гель согласно методу Лаемли. HBsAg и CS белковую последовательно5 сти идентифицирую с помощью методики иммуноокрашивания белка.

После нанесения белков на нитроцел- люлозном фильтре фильтр предварительно инкубируют в течение 1 ч при 37°С с 3%

0 желатиной в PBS. Фильтр последовательно промывают пять раз в течение 5 мин каждый раз PBS, содержащим 0,1% Tween-20, и од- лу половину пластины обрабатывают в течение 1 ч при комнатной температуре смесью

5 пяти моноклональных антител против CS белка в PBS 1 % желатины. Другую половину пластины обрабатывают моноклональным антителом против HBsAg, Неру TAS 12, в PBS, 1% желатина. Фильтровальные пла0 стины промывают 5 раз в течение 5 мин каждый раз с PBS, 0,1 % Твин-20 и добавляют биотинированные антитела овцы к IG мышцы в PBS 1 % желатины в течение 1 ч при комнатной темпера:уре. Пластины снова

5 промывают PBS, 0.1 % Твин-20,5 раз в течение 5 мин каждый раз и инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре с комплексом стрептакидинбиотинсодержа- щей пероксидазой хрена (HRP), Пластины снова промывают 3 раза по 5 мин, каждый

раз PBS, 0,1% Твин-20, и инкубируют с 30 мкл H2U2 и HRP-содержащими 4-хлорол- нафтола, 30 мг в 10 мл метанола, в 50 мл PBS.

Молекулярный вес антигенов оценива- ют с помощью предварительно окрашенных белковых маркеров, овальбумина, альфахи- мотрипсиногена, бета-лактоглобулина, ли- зоцима, цитохрома C(BRL).

Оба дрожжевых штамма DC5 и 10S 44 С, трансформированные с pRITI2573, синтезируют антиген, реагирующий как с анти-CS. так с анти-HBs Ад антителами, и их молекулярный вес составляет 30000 кило- дальтон (kd). Оба дрожжевых штамма DC5 и 10S 44С, трансформированные pRITI2574 или с pRITI2658, синтезируют антиген, способный реагировать как с анти-CS, так и с анти-HBsAg антителами и молекулярный вес белка составляет 37000 kd.

Эти результаты показывают, что гибридный белок ожидаемого молекулярного веса, содержащий как CS, так и HBsAg- последовательности, синтезируется в дрожжах, трансформированных плазмидой, содержащей CS кодирующую последовательность, слитую с кодирующей последовательностью Pre S2- HBsAg.

Пример 12. Дрожжевые (Saccharomyces cerevlsiae) штаммы DCS или 10S 44С, содержащие или pRIT10172, pRIT12329, PRU12573 или pRIT12574, выращивают в селективной среде (200 мл VNB или VNB + 80 мкг/мл гистидина) до конца лог-фазы. Клетки отбирают центрифугиро- ванием и вновь суспендируют в 10 мл 50 мМ буфера из фосфата натрия (рН 7,4), содержащего 0,5% Твин-20 (полиоксиэти- ленсорбитанмонолаурат), 1 ммоль PMS (фенилметилсульфонилфторид) и 2,5% изо- пропанола. Клетки разрушают путем пропускания через французский пресс при 20000 Psi (1,38х108 Па). Суспензию центрифугируют в течение 30 мин при ЗООООхд.

Измеряют общую концентрацию белка в верхнем слое жидкости (сырой клеточный экстракт) использованием бычьего сывороточного альбумина в качестве стандарта. Наличие HBsAg определяют с помощью радиоиммунного испытания. Наличие CS-no- следовательностей в HBsAg частицах испытывают в ELISA тестах. Соответствующие разбавления образцов, которые испытываются (в PBS, содержащем 0,2% BSA). позволяет проводить реакцию (в течение ночи при комнатной температуре) в твердой фазе анти-HBsAg. Связанные HBsAg частицы инкубируют в течение 1 ч при 37°С 1/10000 разбавлением (в PBS, содержащем 0.1% BSA) смеси пяти моноклинальных антител, причем первое антитело к CS белку, и затем инкубируют с 1 /500 разбавлениями (в PBS, содержащем 0,1% BSA) биотин содержащего анти-мышиного Jg овцы в качестве второго антитела в течение 1 ч при 37°С Инкубируют с 1/1000 разбавлением (в PBS, содержащем 0,1% BSA) комплекса стрептавидин-биотинсодержащей перокси- дазы хрена и хромоген в течение 30 мин при 37°С.

Измеряют концентрацию белков и активность в сырых клеточных экстрактах. Плазмида pRIT12574 показывает более чем в раз меньшую активность.

Активность AUSRIA в сырых клеточных экстрактах приведена в табл.1.

Опыт ELISA показывает, что pRIT12573 и pRIT12574 кодируют HBsAg и CS эпитол.

1 мл сырых клеточных экстрактов смешивают с 1.5 М CsCI в 50 мМ растворе фосфата натрия (рН 7,4) и центрифугируют в течение 40 ч при 40000 g в ультрацентрифуге. Отобранные фракции испытывают на присутствие HBsAg и CS антигенов.

Анализ на иммуноокраску градиентных фракций подтверждает результаты RIA/ELISA. HBsAg и/или CS-последователь- ности обнаруживают только в тех фракциях, которые не реагируют в испытаниях RIA/ELISA (табл.2).

HBsAg и CS элитопы, присутствующие в антигенах, связанных с иммобилизованными анти-HBs Ад антителами приведены в табл.2.

Эти результаты указывают, что гибридный протеин, получаемый при экспрессии PRIT12573 и pRIT12574. объединяется в частицы, подобные 22 нм частицам HBsAg при синтезе в клетках дрожжей.

П р и м е р 13. Неочищенный клеточный экстракт дрожжевого штамма 10S 44С, содержащий pRIT12574, осветляют осаждением полиэтиленгликолем (PEG) 400 и концентрируют ультрацентрифугированием.

Дальнейшую очистку гибридных частиц проводят CsCI центрифугированием, гидро- ксиапатитной хроматографией и гель-фильтрацией.

Окончательно очищенный от клеточного экстракта 10S 44С pRIT12574 дает один основной пик на колонке HPZC Т5К-300(ЛКВ), который содержит антитела HBsAg и CS. Электрофорез на SDS полиакриламидном геле с последующим окрашиванием серебром дает одну основную полосу молекулярного веса 37000 kd. Данные электронной микроскопии после окрашивания уранила- цетатом дают примерно такие же значения

размеров и формы частиц, что и для HBsAg, полученным из дрожжей.

Серые дрожжевые экстракты получают разрушением дрожжевых клеток в присутствии равного веса 50 мМ иатрийфосфатно- го буфера для экстракции (рН 8,1), дополненного 4 мМ Titrlplex III, 1 % Твин-20, 4 мМ PMSF и 10% изопропанола. Клеточные осколки удаляют центрифугированием при 11000 g в течение 90 мин, 50 мл отцентри- фугированного экстракта доводят до рН 7,2 1 н. уксусной кислотой и перемешивают в течение ночи при 4°С в присутствии 10 г коллоидной двуокиси кремния. Затем суспензию центрифугируют при 3,500 g в тече- ние 1 ч и полученный осадок промывают трижды 150мл 0.15 М NaCI, дополненного 2 мМ PMSF и 5 мМ ЕДТА в течение 15 мин. Элюируют 250 мл 10 мМ фосфатного буфера (рН 9,5), содержащего 2% Твин-20 при 37°С в течение 3 ч. К десорбату добавляют по каплям Ш раствор CaCl2 до окончательной концентрации 30 мМ CaCIa и устанавливают рН 7. Полученный раствор оставляют на ночь при 4°С и центрифугируют при 6500 g в течение 15 мин. Надосадочную жидкость подвергают диализу (2x51x10 мМ трис-HCI, рН 7,1) при 4°С и затем разбавляют 4 раза диализным буфером.

После добавления 30 мМ CaCIa и Ш NaCI разбавленный раствор антигена с рН 7,1 пропускают над колонкой 150 мл с фе- нил-сефарозой, уравновешенной тем же CaCl2(NaCI, содержащим трис-буфер со скоростью потока 30 см/ч. Последовательно колонку промывают равновесным буфером до тех пор пока OD280 нм (оптическая плотность) не снижается до 0, и элюируют с той же самой скоростью потока 6М мочевины в 10 мМ трис-HCI рН 9.

В другом варианте деализованный и разбавленный в четыре раза раствор антигена дополняют 20% NH4/2 SO/1 (pH 7) и пропускают над 150 мл колонкой с фенил- сефарозой, уравновешенной в 10 мМ трис- HCI, рН 7,1 20% (NH4)aS04 со скоростью потока 30 см/ч. После промывания колонки уравновешивающим буфером колонку элюируют с той же самой скоростью потока 10 мМтрис-НС1рН7,1.

Собирают антигенположительные фракции и в заключение центрифугируют с одним или двумя подходящими CsCI градиентами плотности при 4°С и 245000 g в течение 65 ч. Очищенные гибрид ные CS-HBsAg частицы имеют плавучую плотность 1,23 г/см3.

П р и м е р 14. Гибридные частицы, выделенные из S.serevisiae штамма 10S 44С ррИ 12574, инокулируют лабораторным

животным в чистом виде или с адьювантом алюминийгидроксидом.

Мышей штамма С57В1/6 (6-8 недель), морских свинок и кроликов иммунизуют подкожно и внутрибрюшинно в 1, 21 и 49 дни. Кровь отбирают на 7, 28, 56 и 84 день. Кровь оставляют до свертывания при 4°С в течение ночи, а полученную сыворотку выделяют и хранят при -70°С до применения.

Кролики (2 группы по 2 кролика в каждой) получают 10 мкг гибридного CS-HBsAg протеина в дозах по 1,0 мл с добавлением или без добавления гидроокиси алюминия при каждой иммунизации. В качестве контроля 2 кроликов иммунизируют 10 мкг Нера- та Vax В . Мыши и морские свинки в группах по 5 животных получают по 1 и 5 мкг гибридного протеина соответственно, в дозах по 0,5 мл при каждой иммунизации. Неиммунизированные животные служат в качестве контроля.

Для определения реакции антител сыворотку, полученную от мышей, собирают для каждой группы, тогда как сыворотку от морских свинок и кроликов анализируют индивидуально. Анти-С5-антитела тритры измеряют анализом ELISA, используя рекомбинантный CS протеин Р32тет32 в качестве антигена. Анти-HBsAg титры определяют, используя AUS АВ набор и WHO для сравнения.

Ни у морских свинок, ни у мышей не вырабатываются антитела к HBsAg, несмотря на повторные инъекции. Напротив, оба вида животных вырабатывают анти-CS антитела, и это усиливается при повторах. Поглощение 1,0 в анализе ELISA достигают при сывороточных разбавлениях в 1600 раз (мыши) и 9000 раз (морские свинки). Имму- ногенность гибридных частиц не возраста- тет при адсорбции на гидроокиси алюминия.

Кролики вырабатывают антитела, как к CS, так и к HBsAg. Обратные титры при поглощении 1,0 в анти-CSELISA анализе да- ют значения между 800 и 3200 ми/1 мл. Анти-HBsAg титры, полученные для гибридных частиц, адсорбированных на гидроокиси алюминия, находятся между 4000 и 20000 ми 1 /мл, тогда как для кроликов, иммунизированных Нерта Vax, титры имеют значения от 105 до 10 ми 1 /мл. Адсорбирование гибридных частиц на алюминийгидроксиде повышает иммунную реакцию (табл.3).

CSP реакционная способность и процент ингибирования вторжения спорозои- тов (% IS) HepG2-A 16 гептомы клеток дана в табл.3.

П р и м е р 15. Вакцину получают следующим образом. К буферированному водному раствору 3%-ной гидроокиси алюминия (10 мМ раствор фосфата. 150 мМ NaCI, pH 6,8, стерилизовано фильтрованием) добавляют полученные частицы в аналогичном буфере при перемешивании до конечной концентрации 100 мкг/мг полипептида и 0,5 мг/мл алюминия (А13. рН поддерживают 6,8. Смесь оставляют на ночь при температуре около 0°С. Добавляют Thlmersol до конечной концентрации 0,005%. Проверяют и устанавливают рН при 6,8.

П р и м е р 16. Плазмиду рШТ12290 модифицируют введением BamHI-EcoRI синтетического адапторного фрагмента, ко- дирующего N-терминальные аминокислоты pre S 2 участка между TDH3 промоторными APG3 терминаторными фрагментами.

Плазмиду pRIT12290 расщепляют BamHI и EcoRI ферментами и дефосфорили- руют щелочной фосфатазой. 20 пмоль фос- форилированного синтетического адаптера:

Gin Trp BamHI 5 GATC CAG TGG3 EcoRI

З1GTC АССТТАА 5

связывают с 0,1 пмоль BamHI-EcoRI фрагментом дефосфорилированной ллэзмиды pRIT1229t), используя 1 ед. (и) Т4 лигазы, и используют для трансформации E.coll штамма ММ294. Один трансформант, со- держащий целевую плазмиду с синтетическим адаптером, включенным между BamHI и EcoRI сайтами, идентифицируют.

30 пмоль (120 мкг)ртТ12621 ДНК обрабатывают 120U BamHI. После удаления ре- стрикционного фермента экстракцией фенолом плазмиду осаждают этанолом и ре- суспендируют в соответствующем буфере для обработки BamHI нити и 280 ед. (U) нуклеазы фасоли золотистой. Нуклеазу уда- ляют фенольной экстракцией с последующим осаждением этанолом. Обработанную таким образом плазмиду повторно суспендируют в буфере для лигирования и рецир- кулируют 10 ед. Т4 лигазы.

Препарат, содержащий сшитую ДНК, обрабатывают фенолом, осаждают этанолом, ресуспендируют в соответствующий буфер и расщепляют EcoRI ферментом. После удаления EcoRI сайта, 0,05 пмоль (0,2 мкг) ДНК суспендируют в буфере (для лигирования с 0,4 пмоль (0,2 мкг) EcoRI фрагмента размером 838 п.о., выделенного из pRIT12581, который содержит полный G- терминальный кодирующий участок pze S2- S протеина. Вектор pUC9 расщепляют EcoRI эндонуклеазой и обрабатывают щелочной фосфатазой, Плазмиду pRIT106l6 (АТСС 39131) расщепляют EcoR8 м Асе ре- стрмкционными эндонуклеазами и 826

EcoRI-AccI фрагмент, содержащий часть pet S2-S выделяют с помощью препаративного акриламидного гель-электрофореза и элект- роэлюирования. Около 0,4 пмоль (0,2 мкг) этого фрагмента смешивают с примерно 10 пмоль следующего синтетического адаптера:

Туг Не Stop 5 ATACATTTAAG 3

ACCIEcoRI

3 TGTAATTGCTTAA 5 и полученную смесь обрабатывают Т4 ДНК лигазой и расщепляют EcoRI рестрикцион- ной э ндонуклеазой. К обработанной таким образом смеси добавляют около вектора pU С 90,2 мкг EcoRI эндонуклеазы и щелочной фосфатазы и полученную смесь обрабатывают Т4 ДНК лигазой и используют для трансформации компетентных клеток E.coll К12, устойчивых к ампициллину.

Колонии исследуют на присутствие плазмиды, содержащей фрагмент 2650 Ьр pUC9 вектора с EcoRI фрагментом 838 Ьр EcoRI, содержащим 826 bp EcoRI-AccI pre S2-S фрагмент, вместе с 12 bp Accl-EcoRI синтетическим линкером. Правильность конструкции проверяют путем определения последовательности ДНК.

Смесь, содержащую плазмиду ДНК PRIT12621 и 838 bp EcoRI фрагмент pRIT12581, используют для трансформации E.coll штамма ММ294. Трансформант, содержащий плазмиду с EcoRI фрагментом в правильной ориентации, идентифицируют как pRIT12662.

П р и м е р 17. ДНК плазмиды pRIT12309 расщепляют Sail эндонуклеазой и лигируют с 2218 bp Xhol-Sall фрагментом ДНК с LEU 2 геном. Лигированную смесь используют для трансформации клеток E.coll K12 штамма JA221.

Идентифицируют плазмиду pRIT12377 из колонии трансформатов. Эта плазмида содержит 2218 bp LEU2Xhol-Sall фрагмент, встроенный по Sail сайту pRIT12309,

Hind III фрагмент размером 3050 пар оснований из pRIT12662 кодирующий pre S2-S белок, очищают электрофорезом на акриламидном геле, обрабатывают Т4 пол- имеразой и лигируют с pRIT12377; предварительно обработанной BamHI ферментом и вновь сшитой Т4 полимеразой. Этот препарат используют для трансформации штамма E.coll ММ294, устойчивого к ампициллину

Плазмиду pRIT12660 используют для трансформации двух штаммов S.cerevlslae, т.е. штамма ДС5 и штамма 10S 44С cir°.

П р и м е р 18. Участок pre S2 плаэмиды PRIT12662 секвенкируют, при атом обмеруживают, что имеются изменения четырех пар оснований, которые приводят к изменению трех аминокислот при сравнении с другим вирусом adW 2 серотипа. Аланиновый остаток вместо треонинового остатка в положении 45, фенилаланин вместо лейцина в положении 34 и сериновый остаток вместо изолейцинового остатка в положении 11.

П р и м е р 19. Дрожжи (S.cerevisiae) штамм ДС5 clr° или 10S 44С cir°, содержащие плазмиду pRIT12660 или плазмиду pRIT12363 (пример 16) выращивают в селективной среде (200 мл YNB + 80 мкг/мл гис- тидина ДС5 clr° или YNB/10S 44С clr° и log фазе). Клетки собирают центрифугированием и ресуспендируют в 50 мМ натрийфосфа- та, рН 8,0 с содержанием 0,5% Твин-20 (полиэтиленсорбитанмонолаурат), 1 мМ PMSF (фенилметилсульфонилфторид) и 2,5% изопропанола. Клетки разрушают, пропуская дважды через пресс давлением 20000 пси (1,38хЮ8 Па). Эту суспензию центрифугируют в течение 30 мин при 30000 д. Определяют полную концентрацию, протеина в надосадочной жидкости (неочищенные клетки в экстракте) с применением бычьей сыворотки в качестве стандарта. Наличие материала, связанного с HBsAg, определяют с помощью набора для радиоиммунного анализа (AUSRIA). Полученные результаты указывают, что pRIT12660 экспрессирует полипептид, обладающий антигенной активностью HBsAg.

В радиоиммунном анализе неочищенные клеточные экстракты из pRIT12660 дают положительную реакцию, тогда как неочищенные клеточные экстракты из pRIT12363 не дают положительной реакции.

Вышеприведенные результаты показывают, что дрожжевые клетки, содержащие pRIT12660, экспрессируют HBsAg

AUSRIA активности в неочищенных клеточных экстрактах даны в табл.4.

П р и м е р 20. Дрожжи, трансформированные pRIT22660, выращивают в селективной среде, либо в колбах Эрленмейера, либо в ферментерах в log фазе и собирают центрифугированием.

К клеткам (0,1 г) добавляют вначале 20 мкг 40 мМ PMSF в изопропаноле. а зятем 200 мкл образца буфера для электрофореза на SDS-полиакриламидном геле (0,125 М трис-HCI, рН 6,8, содержащий 20% глицерина, 4% SDS, 6 М мочевины и 10% 2-меркап- тоэтанола). Образцы вращают и аликвоты 2-20 мкл разбавляют далее в образце буфера до конечного объема 40 мкл, инкубируют в течение 5 мин при 100°С и обрабатывают электрофоретически

После электроблоттинга протеинов на нитроцеллюлозном фильтре полученные фильтры предварительно инкубируют в течение 1 ч при 37°С с 3% желатина в pBS.

Фильтр инкубируют с моноклональными антителами к HBsAg и наличие связывания определяют последовательным инкубированием с биотинированным овечьим антимышиным Ig (разбавление 1/250 в PBS,

содержащем 1% желатина), стелтавидин- биотилированным комплексом пероксида- зы хрена (разбавление 1/400 в PBS, содержащем 1% желатина) и, наконец, 30 мкл На02 и HRP-реагентом проявления цвета, содержащим 4-хлор-1-нафтол, 30 мг в 10 мл метанола промывают PBS, содержащим 0,1% Твин-20.

Иммуноблот дает 4 полосы протеина,

связанные с S-протеином определенного молекулярного веса 33, 30, 28 и 25 kd. Основную часть связанного с S материала обнаруживают в полосе протеина 33 kd. Наименьшая детектируемая полоса протеина мигрирует медленнее, чем S протеин, синтезированный в дрожжах.

П р и м е р 21. Измельчают дрожжевые клетки в присутствии буфера (200 мМ трис, 3 М NaCI, 10 мМ ЕДТАа, 10 мМ этиленгликоль-бис (бета-аминоэтиловый эфир) N, N, N, N-тетрауксусной кислоты (EGTA), 4 мМ PMSF 10% изопропанола) с последующим центрифугированием в течение 45 мин при 30000 д.

Клеточные экстракты pRIT12660 частично очищают от клеточного экстракта ультрафильтрацией, CSCI равновесным центрифугированием и гидроксиапатитной хроматофафией 4 полосы протеина S-связанного материала детектируют на этих стадиях очистки анализом Вестерн-блот, очищают на этих стадиях очистки. Иммуноб- лотный анализ AUSRIA положительных CSCI фракций после равновесного центрифугирования показывает, что четыре S-связанные полосы присутствуют в тех же относительных соотношениях в каждой фракции.

П р и м е р 22. Сывороточный альбумин человека полимеризуют глутаральдегидной

обработкой и очищают. Очищенные клеточные лизаты pR1T122660 разделяют электрофорезом на акриламидном геле и переносят на нитроцеллюлозную мембрану. Нитро- целлюлозный фильтр последовательно инкубируют с PHS А (15 мкг) мл в PBS, содержащем 1% желатина), антисывороткой кролика к альбумину человека, биотинированным анти-кроличьим Ig обезьяны (1/250 разбавление в PBS, содержащем 1% келатина), стрепавидин-биотинированного

пероксидаэой хрена (1/400 разбавление в PBS, содержащем 1 % желатина)и, наконец, Н202 и 4-хлор-1-нафтол.

Две самые крупные S-связанные протеиновые полосы ( 33 kd и 30 kd) подвергают взаимодействию с рН SA, а две самые меленькие (28 и 25 kd) не дают реакции.

П р и м е р 23. Синтезируют петид со следующей формулой: NHa-Met Glu-Trp- Asn-Ser-Thr-Ala-Phe-Hls-G n-Ala-Leu- Gln-Asp-Pro-Arg-Val-Arg-Gly-Leu-Tyr-Le u-Pro- Ala, Gly-Cys-COOH. Кроликов иммунизируют подкожно 100 мкг конъюгата (что соответствует 20 мкг пептида) в полном адъ- юванте Фрейнда, повторно иммунизируют на 8 и 15 день следующими 10 мкг конъюгата в полном адъюванте Фрейнда, а на 28, 69 и 149 день 100 мкг конъюгата в PBS. За выработкой титра антител следят, отбирая образцы крови через определенные промежутки времени, и проверяют разбавление сыворотки инкубированием на синтетическом полипептиде, фиксированном на твердой фазе. Связанные антитела детектируют иодированным протеином А. Сыворотку используют после 100-кратного разбавления или после частичной очистки IgG, IgG частично очищают осаждением NaaS04 (120 мг на 1 мл сыворотки), повторно суспендируют в PBS и переосаждают 14% N32S04. Повторно суспендированный Ig раствор обессоливают, пропуская через PD 10 колонку.

Определение реакционной способности протеинов в иммуноблотах осуществляют с помощью биотинированного анти-кро- личьего Ig обезьяны, стрепатавидин-биоти- нированной пероксидазы хрена и Н20а и 4-хлор-1-нафтолом.

Протеины из частично очищенных препаратов pRIT12660 выделяют электрофорезом на SDS полиакриламидном геле и переносят на нитроцеллюлозу. Иммуноблот показал, что две более крупные полосы протеина (33 kd и 30 kd) реагируют с антителами.

П р и м е р 24. Частично очищенный препарат диссоциируют с помощью SOS и протеины разделяют электрофорезом на ак- риламидном геле. После переноса протеинов на нитроцеллюлозу полученные мембраны инкубируют с десятикратно разбавленным гамма-глобулином гепатит В, содержащим 1% желатина. Связывание антител определяют последовательным инкубированием с помощью биотинированного античеловеческого Ig овцы (1/250 разбавление в PBS, содержащим 1% желатина), стрептавидин-биотинированной пероксидазы хрена, .и наконец. Нг02 и 4-хлор-1-нафтолом.

Две наиболее крупные протеиновые полосы (33 и 30 kd полосы) подвергают взаимо- действию с антителами человека, две наименьшие (28 и 25 kd полосы) не дают 5 реакции. S протеин, полученный из частиц из дрожжевых клеток, содержащих pRIT12363. не взаимодействует с этими человеческими антителами.

0 П р и м е р 25. Pre S2-S протеин из частично очищенных препаратов частиц из pRIT12660, содержащих 10S 44Cclr° клетки, разделяют электрофоретически и переносят на нитроцеллюлозу. Прогоняют на геле S

5 протеин, очищенный из дрожжей, содержащих pRIT12363 и HBsAg частиц из сыворотки инфицированных людей. 1/2 нитроцеллюлозного фильтра инкубируют в 50 мкг/мл конканавалина А в 10 мМ трис рН

0 7,5, 150 мМ NaCI. 1 мМ CaChz, 1 мМ MnCfe. 0,05% Твин-20 и затем 30 мкг/мл пероксидазы хрена в ЮмМтрисрН 7,5,150 мМ NaCI 0,05% Твин-20 и, наконец, и 4-хлор-1- нафтола.

5 Между инкубациями фильтр промывают 10 мМ трис рН 7,5, 150 мМ NaCI. 0.05% Твин-20. Другую половину нитроцеллюлозного фильтра инкубируют с моноклональ- ным антителом 6.

0 Полоса 33 kd протеина реагирует с кока- навалин N-пероксидазными реагентами, хотя ни одна из полос протеина 30, 28, 25 kd из дрожжных клеток, содержащих pRIT12363, не реагирует. В присутствии 0,1

5 М метил-альфа-О-маннопиранозида связывания конкавалина А с 33 kd протеином не происходит.

П р и м е р 26. Клетки, содержащие с PRIT12660 и pRIT12377, выращивают в се0 лективной среде (YNB + 80 г/мл гистидина /DCS clr° или YNB/ 10S 44С clr0 до значения 00б20пм 0,2. Туникамицин добавляют до конечной концентрации 10 /л г/мл и культуры инкубируют в течение 3 мин при 30°С.

5 Затем добавляют 20 fin CI S-метионина (1000 Cl/ммоль) на 1 мл смеси и культуры инкубируют еще в течение 15 мин. Меченую клеточную культуру в количестве 2 мл, обработанную или необработанную туникамици0 ном, центрифугируют в микрофуге и спрессованные клетки повторно суспендируют в 40/ 1 % SDS, после чего их разрушают путем перемешивания в смесителе в течение 2 мин в присутствии 0,3 г стеклян5 ных шариков (диаметр 0,45-0,50 мм).

Проводят иммунное осаждение. Лизат нагревают в течение 3 мин при 100°С, разбавляют 0,5 мл PBS, содержащей 1хТритона Х100, 0,5% деоксихолата 0,1% SDS и снова нагревают в течение 1 мин при 100°С.

К кипящему экстракту добавляют 25 мл 10%-ной суспензии предварительно промытого иммунопреципитина и систему инкубируют в течение 30 мин при 0°С. Полученную смесь осветляют центрифугированием в течение 5 мин на микрофуге. К верхнему слою жидкости добавляют 2,5 мл моноклонального антитела 6 специфичного к S протеину полученную смесь инкубируют в течение 1 ч при 0°С. Затем добавляют еще одну порцию (25 мл) иммунопреципитина и полученную смесь инкубируют в течение 30 мин при 0°С. Имунные комплексы собирают центрифугированием (5 мин в микрофуге) и промывают PBS, содержащей 2 М мочевины, PBS, содержащей 1 % 2-меркаптоэтано- ла, и наконец PBS. Окончательно промытые гранулы повторно суспендируют в буферном растворе.

Образцы, содержащие 105срт, подвергают электрофорезу через 12,5% SDS поли- акриламидный гель. После электрофореза гели фиксируют в 40%-ном метаноль- ном растворе 10%-ной уксусной кислоты, обрабатывают для флюорографии, сушат на фильтровальной бумаге в вакууме и подвергают флюорографии с использованием пленки при 70°С.

В результате показано, что дрожжевые клетки, содержащие pRIT12660. синтезируют 33 kd протеин в отсутствии туникамици- на и 30 kd протеин в присутствии туникамицина. Обе полосы отсутствуют в соответствующих образцах клеток, содержащих pRIT12377.

Полученные результаты показывают что 33 kd pre S2-S протеин, экспрессированный в дрожжевых штаммах D65 с1г°„ несет оли- госахаридную часть, М-гликозидно-связан- ную с аспарагином.

П р и м е р 27. Олигосахаридная структура.

Сырые клеточные экстракты клеток, содержащие pR T12660 или частично очищенные препараты, содержащие pre S2-S частицы из таких экстрактов, обрабатывают эндо-М-ацетилклюкозамимидазой из Streptomyces plicatus.

Частично очищенные частицы (50 мл, 450 мг/мл протеина) кипятят в течение 3 мин при 100°С л в присутствии 0,1% доде- цилсульфата натрия, разбавляют 10 раз 100 М натрий-цитрата с рН 5 и к 240 мл такой смеси добавляют 2,4 мл эндо Н (74 мг/мл). Образцы, содержащие и не содержащие эндо Н, инкубируют в течение 2 ч при 37°С. Анализ образцов, обработанных и не обработанных эндоН, осуществляют с помощью

SDS-поликриламидного гель-электрофореза и иммуноокрашивания с детекцией моно: клональным антителом 6 к протеину S. позволил установить исчезновение полосы,

соответствующей 33 kd, и появление полосы 31 kd в ходе обработки эндо Н. Полоса 31 kd продолжает реагировать с конканавалин А- пероксидазными реагентами. Положение других полос (30, 28 и 25 kd) не изменяется

в ходе обработки эндо Н. Аналогичные результаты получают и при более длительной инкубации или при более высоких концентрациях эндо Н.

Пример 28. Сырой дрожжевой экстракт, содержащий pre S2 S частицы, готовят измельчением дрожжевых клеток в присутствии эквивалентного весового количества экстракционного буфера, представляющего собой 50 тМ фосфата натрия с рН 8,1 4 тМ ЕДТА, 1,0% Твина-20, 4 mM PMSF и 10% изопропанола или 200 тМ трис-HCI с рН 9,0, 3,0 М NaCI, 10 mM ЕДТА, 10 тМ EGTA (этиленгликоль-бис-(бета)-аминоэтиловый эфир N, N, N , N -тетрауксусной кислоты), 1% Твина-20, 4 mM PMSF и 10% изопропанола.

Устанавливают рН гомогената, равным 8,0 или 9,0 соответственно, и после этого его

центрифугируют в течение 45 мин при ЗООООхд.

К 500 мл сырого дрожжевого экстракта с рН 7,2 добавляют 10 г коллоидного оксида кремния.

Коллоидную суспензию перемешивают в течение ночи при 4°С и затем центрифугируют с низкой скоростью вращения, Гранулы трижды промывают 150 мл 0,15 М раствора NaCI в течение 1/4 ч и затем периодически элюируют 250 мл 10 тМ пирофос- фатного буффера (рН 9,3), содержащего 2% Твина-20. причем реакцию проводят в течение 3 ч при 37°С. Десорбат, представляющий собой желтоватый, ярко опалесцирующий

раствор, пропускают через 50 мл колонку с фенилборонатной а га розой, уравновешенную 10 тМ раствором пирофосфатного буфера с рН 9,0. Объемная скорость 15 мл/ч. Колонку дополнительно промывают 2

объемами уравновешивающего буфера и затем элюируют в обратном направлении 100 тМ сорбита 0 50 тМ трис (рН 7.2) при объемной скорости 15 мл/ч. Элюирован- ные целевые фракции сливают и после установления рН 8,1 пропускают через колонку с ДЕАЕ-фрактогель TSK, уравновешенную 50 тМ раствором трис с рН 8,2, Частицы элюируют тем же буфером, содержащим 75 mM NaCI. После этой стадии удаляют оста вшиеся нуклеиновые кислоты (до содержания 1 мкг/20 мкг протеина).

Результаты материального баланса представлены в табл.5.

Готовят материал, очищенный от экс- трактов дрожжевых клеток, содержащих pRIT12660, с последующим разновесным центрифугированием в присутствии CSCI, после чего этот материал подвергают исследованию на электронном микроскопе после окрашивания его ацетатом уранила. В результате такого исследования обнаруживают наличие структур дискретных частиц с диаметром 19 мкм и установлено, что содержание таких гибридных частиц составляет 5-20 мкг Тоина-20 на 100 мкг протеина.

П р и м е р 29. Аэросил-десорбат в количестве 50 мл пропускают через 5 мл колонку с чечевичной агарозой, уравновешенной уравновешивающим буфером, (трис-буфер) в количестве 10 тМ (рН 7,2). 0,14 MNaCI и 0,3% Твина. Колонку промывают двумя объемами уравновешивающего буфера 10 гпМ (рН 7,2) и затем элюируют сахаром, облада- ющим специфичностью на чечевицу, таким как 0,5 М альфа-метилманнопиранозид в уравновешивающем буфере.

Результаты материального баланса представлены в табл.6.

В результате исследования устанавливают, что гибридные частицы содержат 5-50 мкг Твина-20 на 100 мкг протеина.

П р и м е р 30. Иммуногенность частиц, полученных из экстрактов клеток, содержа- щих pRtT12660. изучают на двух штаммах мышей: Balb/c (Ha-d) и NMRI (На-О). Перед инъекцией частицы адсорбируют на AI (ОН}3 и мышам (5 мышей на группу) внутрибрю- шинно вводят по 0,3 мкг RIA реагирующего материала. Через 1 мес после иммунизации мышей умертвляют, спускают кровь и сыворотку мышей одной группы сливают. Титр антител к S-белку в полученных препаратах определяют с использованием набора AUSAB (Аббот Лабе) и стандарта WHO, антитела к per-S2 пептиду определяют с использованием анализа в твердой фазе (RIA), согласно которому синтетический рге S2 пептид абсорбируют на пластмассе и свя- занные антитела определяют с помощью анти-мышиного IgG кодона, меченого изотопом 1251. Результаты, приведенные в табл.7, показывают, что экстракты дрожжевых клеток, содержащие pRIT12660, индуцируют анти-S рге S2 антитела в обоих штаммах мышей, причем у мышей штамма NMRI индуцируются более высокие титры анти-рге S2 антител, чем у мышей штамма Balb/c. Титр антител к S белку, полученный у мышей

штамма Balb/c или NMRI в 2-3 раза выше, чем титр, полученный при более высокой дозировке из дрожжевых клеток, содержащих pRIT12363.

Результаты по изучению иммуногенно- сти, относящиеся к частицам Рге S2-S суммированы в табл.7.

Титр представляет собой разбавление, обеспечивающее значительное связывание антитела (в 2,5 раза превышающее значение, полученное на отрицательной контрольной сыворотке).

П р и м е р 31. Первая стадия представляет собой слияние ТДНЗ промоторного участка с рге SIN-терминальным участком HBV генома. Исходное вещество представляет собой плазмиду pRIT12792, содержащую фрагмент Ncol-Xbal размером 495 Ьр с S1-Pre S2 кодирующей последовательностью за исключением последнего аспараги- нового кодона.

Оба фрагмента Ncol-Xbal, содержащиеся на pRIT12792 и pRIT12793. получают из ДНК рге S1-pre S2 штамма вируса гепатита В (серотип ddw), клонированного на плазми- де pRIT10616.

PRIT12792 в количестве 52 мкг гидроли- зуют в присутствии Ncol и Xbal эндонуклеаз и обрабатывают нуклеазой фасоли с тем, чтобы устранить 5 ответвления. Обработанный и очищенный 495 bp Ncol-Xbal фраг- мент в количестве 600 п г (2 пмоль) лигатируют с 170 п г (0,02 пмоль) pRIT12314 вектора, предварительно линеаризованного с помощью Bam HI и Smal эндонуклеаз. м обрабатывают «уклеазой фасоли pRlT12314 содержат полный 2 микронный фрагмент S.cerevlslae и ТДНЗ промотор, отделенный от АРСЗ терминатора BamHI-Smal-EcoRI линкером,

BamHIEcoRI

Smal

ATGGATCCCCCGGAATC рТДНзtARCs

Лигированную смесь используют для трансформации E.coll MM294. Отбирают шесть трансформантов, содержащих плазмиду, в которой фрагмент S1-pre S2 вставлен в правильной ориентации. Получают плазмиду pRIT12843 (a...f).

Следующая стадия заключается во внедрении в каждую из плазмид pRIT 12843 (a...f) S кодирующего участка с целью перестройки всего рге S1-S2-S гена.

Эту операцию проводят следующим образом.

Каждую из плазмид pR IT 12843 (a...f) гид- ролмзуют в присутствии рестриктаз BamHI и Salt. BamHI сайт помещают в начало рге S2 участка, тогда как сайт Salt помещают

после APG3 терминатора в pBR 327. Самый крупный фрагмент BamHI-Sall (10 400 bp) в количестве 80 п г (0,012 ммоль), очищенный от плазмид pRIT12843 (a . f), лигируют с 300 п г (0,11 пмоль) фрагмента BamHI-Sall из PRIT12660 4800 Ьр, фрагмент BamHI-Sall pRIT12660 содержит часть pre S2-S кодирующей последовательности, за которой следует APG-терминаторные последовательности и IEY2 дрожжевая последователь- ность. После лигирования и трансформации штамма E.coll ММ294 каждой из плазмид pRIT12843 (a...f) отбирают клоны, содержащие плазмиды, названные pRIT12845 (a ..f) Такие плазмиды pRIT12845 (a...f) использу- ют для трансформации S.cerevislae штамма 10S 44С cir°. Скрининг культур, выросших из индивидуальных клонов трансформацией дрожжей, проводят путем испытания сырых клеточных экстрактов в наборе AYS RIA. Сырые клеточные экстракты готовят путем разрушения дрожжевых клеток, ресус- пендированных в PBS, содержащей 0,5% Твина-20, 2 мМ PMSF и 5% изопропанола. Испытывают по одному трансформанту из каждой из шести отдельных трансформаций в присутствии pRIT12845 (a..,f). Пять из шести испытанных трансформантов дают положительную реакцию при испытании AYS RIA.

Образцы сырых экстрактов подвергают иммунологическому исследованию. Четыре из пяти трансформантов с положительной реакцией при испытании AYS RIA обнаруживают S-родственный протеин ЗЭК. Один трансформант проявляет родственный протеин в 23 К.

П р и м е р 32. Готовят черые клеточные экстракты из дрожжевого штамма 10S 44С cir°, содержащие pRIT12845, pRIT12660 или pRIT12377, и дрожжевого штамма Экстракты из штамма 10S 44C clr°, содержащие pRIT12843 и pRIT12660, показывают сильную антигенную активность HBsAg, которая отсутствует у экстрактов из штамма 10S 44С cir°, содержащего pRrT12377, или штамма ДС5 clr°, содержащего pRIT12363.

Центрифугирование сырых клеточных экстрактов из 10S 44С cir° клеток, содержащих pRIT12845, и измерение HBsAg анти- генной активности методами AYS RIA в CSCI фракциях позволило обнаружить антиген с полосой около rho 1,2 г/см . Активность CSCI фракций в отношении связывания с pre S1 антителами испытывают с помощью анализа EL ISA. После того, как антиген свя- жется с твердо-фазным анти-HBsAg, его инкубируют в присутствии моноклонального антитела МА18/7, которое далее детектируют с помощью биотинированного антимышиного Ig, стрзпдавидин-биотинированно- го комплекса пероксидазы хрена и хромогена

Полученные результаты показывают, что pre S1-pre 52-протеин, продуцированный в 10S 44С clr° клетках, содержащих pRIT12845, скапливается в частицы, аналогично частицам HBsAg, полученным из сыворотки,

П р и м е р 33. Анализируют HBsAg родственные протеиновые мономеры, экс- прессированные в клетках, содержащих PRIT12845.

Миграцию и иммунную реакционноспо- собность клеточных протеинов сравнивают с протеинами из HBsAg частиц, очищенных от человеческой сыворотки.

Для анализа протеинов используют три иммунореагента: - моноклональное антитело к S эпитопу, - поливалентную антисыворотку кролика и pre S2 пептида, - моноклональное антитело МА18/7, специфичное к pre S1 эпитопу.

Анализ иммуно-блотингом показал наличие среди клеточных протеинов клеток 10S 44С pRIT12845 двух протеинов, специфически реагирующих со всеси тремя имму- нореагентами, описанными выше. Устанавливают, что молекулярный вес двух таких протеинов составляет 38.000 и 45.000 дальтонов, pre S1-pre S2-S протеин весом 38000 дальтонов мигрирует несколько быстрее, чем р39 pre S1-pre S2-S протеин из HBsAg частиц.

Данные результаты показывают, что дрожжевые клетки, содержащие рНП 12845, экспрессируют два протеина весом 38 и 45 kd, несущие pre S1. pre S2, а также S-эпитоПЪ1.

П р и м е р 34, Дрожжевые клетки, содержащие pRIT12845, разрушают стеклянными шариками, взятыми в эквивалентном весе (диаметр 0,45-0,50 мм), в равном весе 10 мМ натрийфосфатного буфера (рН 7,4). содержащего 2% SDS и 8 мМ ЕДТА, в результате перемешивания в смесителе.

После центрифугирования верхний слой в течение 4 мин нагревают при 100°С.

Жидкость из нагретого верхнего слоя в количестве 10 мкл разбавляют 40 мкл 25 мМ натрийцитратного буфера (рН 5,0) и добавляют 2 мкл EndoH (74 мкг/мл). Образцы, содержащие и не содержащие добавленный EndoH, инкубируют в течение 2,5 ч при 37°С.

Обработанные и не обработанные EndoH образцы анализируют методом электрофореза на SDS-полиакриламидном геле и осуществляют иммуно-блотинг.

Пятно анализируют с помощью моноклонального антитела 6 МА18/7

В соответствии с анализом методом им- муно-блотинга, как в случае моноклонально- го антитела 6, так и моноклонального антитела МА18/7, наблюдают исчезновение полосы, соответствующей 45 kd и появление полосы 41 kd в ходе обработки EndoH. Обработка EndoH не оказывает влияния на миграцию полосы 38 kd.

Эти результаты показывают, что pre S1- pre S2-S протеины с молекулярным весом 45 kd несут N-гликозидносвязанную олиго- сахаридную цепь высоко-маннозного типа.

П р и м е р 35. Клетки дрожжевого штамма 10S 44С cir°, содержащие pRIT12845, pRIT 12660, или pRIT12377, выращивают в YNB до значения ОД620 нм порядка 0,4.

Клетки (20 мл культуры) метят в течение 60 мин ImCI ЗН-меченой миристиновой кислоты и затем собирают центрифугированием. Полученные клетки промывают холодной НгО, ресуспендируют в 100 мл 3 мМ трис-HCI (рН 7,4), содержащего 3 мМ (ДТТ). 1% SDS и 1 мМ PMSF, и разрушают 100 мг стеклянные шариков в результате шести 30-секундных стадий интенсивного перемешивания б смесителе, причем перед каждой стадией проводят охлаждение льдом. Осколки удаляют путем центрифугирования в течение 1 мин на центрифуге. Экстракт в количестве 20 мкл обрабатывают в течение 3,5 ч при комнатной температуре 7 мкл свежеприготовленного 4 М гидрокси- ламина, 20 М глицина рН 10.

Образцы, обработанные и не обработанные гидроксиламином, подвергают элек- трофорезу на SDS полиакриламидном геле. Образцы, не обработанные гидроксиламином, подвергают анализу методом иммуно- блотинга в присутствии моноклонального антитела, распознающего S эпитоп.

Методом флюорографии устанавливают, что меченая полоса, соответствующая 38 kd, присутствует лишь в клеточном экстракте дрожжевых клеток, содержащих pRIT12845. Меченых полос, специфичных для экстрактов из клеток, содержащих pRIT12550. не обнаруживают.

Эти результаты показывают, что pre S1- S2-S протеин весом 38 kd содержит кова- лентно-связанную миристиновую кислоту, присутствующую в амидной связи. Как правило, миристат ковалентно связывается с протеинами путем амидной связи с амино- терминальным глицином. Этот факт позволяет предположить, что инициирующий кодом для Met удален из pre S1 pre S2-S протеина и что Gly остаток в положении 2 доступен для ациллирования миристиновой кислотой.

П р и м е р 36. Плазмида pRIT12793 содержит pre S 1-рге S2 кодирующую последовательность на Ncol-Xbal фрагменте размером в 495 Ьр. ДНК плазмиды pRIT12793 гидролизуют в присутствии эндонуклеазы Ncol, обрабатывают Т4 ДНК полимеразой для заполнения липких концов и далее гидролизуют в присутствии Xbal эндонуклеазы. Фрагмент Ncol/T4 ДНК полимераза/Xbal очищают электрофорезом на полиакриламидном геле и электроэлюированием и встраивают в вектор pYC12, предварительно обработанный Smal и Xbal эндонуклеаза- ми. Единственный Bst X сайт присутствует на N-конце pre SI кодирующего участка.

Экзогенные кодирующие последовательности ДНК могут быть введены путем гидролиза pRITX.n ее производных эндонук- леазами Bst X и BamHI или EcoRI или Pst I и встраивание этой кодирующей последовательности межлу этими сайтами, в результате чего происходит удаление большей части pre SI кодирующего участка и N-терминаль- ной части pre S2 последовательности. После получения таких конструкций они могут быть рекомбинированы в другие плазмиды, содержащие остаток pre S 1-pre S2 последовательностей, необходимых для сохранения и репликации в E.coll и S.cerevlclae.

Из таких геномных клонов HIY вируса получают различные субфрагменты, как pre S2-S ДНК кодирующие последовательности. Такие гибридные частицы служат основной вакцины для защиты людей от инфицирующего агента HIY.

Исходный материал представляет собой плазмиду pBH10-R2, содержащую геном HIY изолята ВН10. 3108 bp Sall-Xhol фрагмент ДНК вирусного происхождения вырезают из pBH10-R2 и клонируют между Sail и Xhol сайтами плазмиды pYC18 и получают плазмиды pRIT12901.

ДНК pRIT12901 гидролизуют эндонук- леазами Bglit и Mboll и фрагмент размером 117 Ьр выделяют электрофорезом на акри- ламидном геле и электроэлюированием. ДНК фрагмента обрабатывают нуклеазой фасоли с целью удаления однонитевых ответвлений и лигатируют с ДНК pRIT10911, которую переваривают эндонуклеазой BamHI и обрабатывают нуклеазой фасоли. Из лигированной смеси выделяют плазмиду pRlT12893, в которой фрагмент Bglll-Mboll размером в 117 Ьр из pRIT12901 встраивают на pRIT10911. Определяют нуклеотидную последовательность ТДНЗ протомора, слитого с фрагментом HTIY-III Bglll-Mboll размером 117 Ьр. Устанавливают, что такая последовательность имеет вид:

5 ATCCACCAGGACATATCACCCA 34

где первый ATG кодон представляет собой фрагмент ТНДЗ промоторного участка pRIT10911, а вторая группа представляет собой внутренний АТС кодо С7 пептидного фрагмента. Второй АТС кодон перекрывает TGA терминальный кодон. Такой кодон тер- минации находится в той же рамке-считыва- ния, что и первый АТС кодон. Определение последовательности ДНК 3 участка на pRIT12893 позволила установить правильную последовательность слияния, обработанную нуклеазой фасоли Mboll конца HTIY/III фрагмента с pre S2 последовательностью на pRIT10911.

Затем ДНК pRIT12893 обрабатывают в присутствии Hind III эндонуклеазы и выделяют фрагмент размером 3250 Ьр, который очищают электрофорезом на агарозагеле и электроэлюированием. Затем фрагмент Hind III размером 3250 Ьр вставляют в Hjnd III сайт плазмиды YEp13 с целью получения pRIT12894. ДНК плазмиды используют для трансформации клеток дрожжевых штаммов ДС5 и 10S 44С.

Транскрипция и трансляция в дрожжевых клетках С7 слитого -pre S2-S белка ДН К на pRIT12894 приводит в результате к синтезу пептида на 5 остатков, начинающегося с ТДНЗ кодона, а также С7-рге 52-слитого пептида, начинающегося на втором внутреннем АТС кодоне С7 последовательности. Такое слияние содержит 38 аминокислотных остатков С7 пептида вместо 45 остатков

интактивного Bglll-Mboll - обработанного нуклеазой фасоли С7 фрагмента.

ДНК pRIT12901 гидролизуют в присутствии эндонуклеаз Hhal и Hind III, выделяют фрагмент размером 230 Ьр. Этот фрагмент очищают электрофорезом на акриламидном геле и электроэлюированием и обрабатывают ДНК полимеразой с целью заполнения

однонитевых ответвлений. Обработанный таким образом фрагмент вновь лигируют с ДНК pRIT10911, которую обрабатывают BamHI и нуклеазой фасоли. Из лигирован- ной смеси идентифицируют плазмиду

pR T12897, в которую встраивают фрагмент HIY ДНК размером 230 Ьр в правильной рамке считывания с целью слияния с pre S2 последовательностью pRIT10911. Затем ДНК плазмиды pRIT12897 гидролизуют с

Hind III эндонуклеазой и фрагмент размером 3365 Ьр, содержащий ТДНЗ промотор, HIY-pre S2-S, APG3 терминатор, очищают электрофорезом на агарозовом геле и электроэлюированием. Такой 3365 Ьр фрагмент

лигируют с плазмидой YEp13 гидролизован- ной с Hind III эндонуклеазой и получают PRIT12898. ДНК плазмиды (pRIT12898) используют для трансформации клеток дрожжевых штаммов ДС5 и 10S 44С.

Фрагмент синтетической ДНК размером 60 Ьр, синтезируют традиционными способами в виде двух единичных нитей, которые затем подвергают совместной ренатурации:

Использование: генетическая инженерия, получение бифункциональных антигенов, клонирование генов, которые кодируют эти антигены в дрожжах. Сущность изобретения: гибридные полипептиды, содержащие HBsAg, получают в результате культивирования штаммов Saccharomyces cerevislae 1044C или ДС5, трансформированных плазмидами pRIT 12573 или pRIT 12574, выделяют и очищают целевой продукт. 7 табл.

5 GATCTCGACAGGCCCGAA GGAATAGAAGAAGAAGGTGGAGAGAGAЗ1

3 AGCTGTCCGGGCTTCCTTATCTTCTTCTTCCACCTCTCTCT5

5 GACAGAGAGAGATCCCCG3 3 CTGTCTCTGTCTAGGGGCCTAC5

Этот фрагмент имеет 5 Bglli и 3 BamHI однонитевые концы. Примерно 20 г двухни- тевого фрагмента и 300 п г ДНК плазмиды pRIT10911, обработанной BamHI смешивают и лигируют. Идентифицируют лазмиду pRIT12898, выделяют ее и внедряют в нее фрагмент размером 60 Ьр на сайте BamHI PRIT10911. ДНК pRIT12899 гидролизуют с Hind III эндонуклеазой и Hind III фрагмент размером 3200 Ьр очищают электрофорезом на агарозовом геле и электроэлюированием. Hind III фрагмент вставляют на Hind III сайт YEp13, получают плазмиду pRIT12900. Затем ДНК плазмиды pRIT12900 используют для трансформации дрожжевых штаммов ДС5и 10S44C

П р и м е р 38 Дрожжевые штаммы ДС5 или 10S 44С, содержащие YEp13. pRIT10912,

pRIT12894 или pRIT12898, выращивают в жидкой среде, не содержащей лейцина (YNB + 80 мкг/мл гистидина или YNB) и клеточные протеины анализируют методом

иммуноблотинга, используя в качестве первого антитела моноклональное антитело к эпитопу HBsAg человека. pRIT12894, pRIT12363 несет S ген HBV, слитый с ТДНЗ промотором в виде фрагмента Hind III размером 2900 Ьр из pRIT12322, внедренного в дрожжевую векторную плазмиду, идентичную pRIT12377, и продуцирует HBsAg под контролем ТДНЗ промотора. Методом им- муно-блотинга обнаруживают полосу,

родственную S протеину с молекулярным весом порядка 32 kd среди общих клеточных протеинов из дрожжевых штаммов ДС5 или 10S 44С трансформированных с помощью pRIT12894. Полоса, относящаяся к S протеину с молекулярным весом порядка 45 kd, присутствует среди общих клеточных протеинов из дрожжевых штаммов ДС5 или 10S 44С. содержащих pRIT12898, тогда как полоса, относящаяся к протеину S молекулярного веса порядка 29 kd, присутствует среди клеточных протеинов из дрожжевого штамма ДС5, содержащего pRIT10912.

Готовят сырые клеточные экстракты из дрожжевого штамма ДС5. содержащие или pRIT12363, pRIT10912 или pRIT12894. Измеряют концентрацию протеина и активность по AYS RIA. Осуществляют анализ этих экс- трактов методом иммуноблотинга.

CSCI центрифугирование сырых экстрактов и измерение HBsAg антигенности методом AYS RIA в CSCI фракциях позволяет обнаружить антиген, соответствующий

полосе около rho 1,2 г/см3. Этот результат подтверждают методом иммуно-блотинга CSCI фракций.

Дрожжевые клетки штаммов ДС5 и 10S 44С, трансформированные или pRIT12894 или pRIT12898, синтезируют слитый протеин с молекулярным весом порядка 32 и 45 kd, оба из которых несут S этитоп. Формула изобретения Способ получения гибридного полипептида, содержащего HBsAg, предусматривающий конструирование рекомбинантных плазмидных ДНК, кодирующих слитый полипептид, трансформацию полученными ДНК штаммов Saccharomyces cerevislae, выделение и очистку целевого продукта, о т- личающийся тем, что конструируют рекомбинантную плазмидную ДНК PRIT12573. или pRIT12574. трансформируют штаммы S.cerevlsiae 1044C или ДС5.

Таблица 1

Таблица 2

Гликозииирован недостаточно для удерживания на колонке.

Таблица 3

Таблица 4

Таблица 5

Таблица 6

Определение осуществляют с использованием AYS RIA. Определение осуществляют с использованием набора AVS АВ. Определение осуществляют с применением радиационно-иммунологического анализа в твердой фазе и синтетического pre S 2 пептида, адсорбированного на пластмассе.

Таблица 7