Способ получения -рибулозо-1,5-дифОСфАТА Советский патент 1981 года по МПК C07H11/04 A61K31/6615 

1

Изобретение относится к усовершенствованному способу получения О-рибулозо-1,5дифосфата, который может быть использован в биологии в исследовании процессов фотосинтеза и фотодыхания.

Известен способ получения D-рибулозо1,5-дифосфата из рибозо-5-фосфата и аденозинтрифосфата в присутствии ионов Mg+ и трис-буфера с использованием неочищенного бесклеточного экстракта из тиониевых бактерий Thiobacillus 58R в атмосфере инертного газа при комнатной температуре с последующим выделением целевого продукта добавлением к ферментной системе, охлажденной до 4°С, трихлоруксусной кислоты, удалением образовавшегося осадка, обработкой полученного раствора активированным углем и прибавлением к очищенному раствору уксуснокислого бария и этилового спирта до конечной концентрации 30об. %. Выход целевого продукта25% 1.

Недостатками известного способа являются низкий выход целевого продукта (25%), необходимость проведения процесса в атмосфере инертного газа, трудоемкость получения биокатализатора - бесклеточного экстракта из тиониевых бактерий Thiobacillus 58R (требуется фильтрование и сепарирование больших объемов культуры).

Целью изобретения является упрощение процесса и увеличение выхода целевого продукта. Цель достигается использованием в качестве биокатализатора ферментного препарата из листьев бобов, полученного из водного экстракта гомогената листьев путем осаждения при 50%-ном насыщении сульфатом аммония с последующим обессоливанием на колонке с сефадексом, проведением процесса на воздухе при 35-38°С и осаждением целевого продукта после отделения из раствора активированного угля и добавлением уксуснокислого бария,

этилового спирта до конечной концентрации его 50-60 об. %.

Способ получения О-рибулозо-1,5-дифосфата согласно изобретению заключается во взаимодействии рибозо-5-фосфата с аденозинтрифосфатом (АТФ) в присутствии ионов Mg+2 и трис-буфера с использованием ферментного препарата из листьев бобов Vicia Faba L., полученного из водного экстракта гомогената листьев путем

осаждения при 50%-ном насыщении сульфатом аммония с последующим обессоливанием на колонках с сефадексом, процесс проводят на воздухе при 35-38°С, и в последующем выделении целевого продукта

путем добавления к ферментной системе,

охлажденной до 4-5°С, трихлоруксусной кислоты, удалением образовавшегося осадка, обработки раствора активированным углем и прибавлением к очищенному от активированного угля раствору этилового спирта до конечной концентрации его в растворе 50-60 об. %. Выход целевого продукта 1000 мг. Далее бариевую соль 0-рибулозо-1,5-дифосфата переводят в натриевую соль действием сульфата натрия. Выход натриевой соли рибулозо-1,5диофосфата 600 мг.

Пример. 100-300 г свежесобранных листьев бобов разрушают в гомогенизаторе типа РТ-1 в 100-300 мл 50 мМ трис-НС1 буфера рН 8,0, содержащего 10 мМ хлористого магния, 1 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) и 1 мМ дитиотреитола (ДТТ) или р-меркаптоэтанола. Массу фильтруют через капроновую или нейлоновую ткань. Фильтрат центрифугируют при 23000 g в течение 30-40 мин. Для очистки биокатализаторов к суиернатанту добавляют сухой сульфат аммония до 50%-ного насыщения (0,353 г соли к 1 мл супернатанта). Через 30 мин осадок белка отделяют центрифугированием при lOOOOg в течение 10 мин и растворяют в 10-30 мл 25 мМ трис-НС1 буфера рН 8,0, содержащего 0,5 мМ ЭДТА. Раствор белка еще раз центрифугируют при 10000 g 10 мин для удаления нерастворившихся частиц и обессоливают на колонке с сефадексом G-25 размером 2 смХЗО см, уравновещенной тем же буфером. Элюат начинают собирать при появлении в нем светло-коричневой окраски. Собирают 10-30 мл элюата соответственно нанесенному на колонку количеству раствора. Этот элюат или непосредственно супернатант 23000 g добавляют в качестве биокатализатора в инкубационную смесь. Для составления инкубационной смеси (конечный объем 60 мл) готовят следующие растворы: 2 ммоля (навеска 190 мг безводной соли) MgCb растворяют в 5 мл перегнанной из стекла воды, затем в этом растворе растворяют 0,5 ммоля (навеска 77 мг) дитиотреитола.

Оптимальной концентрацией АТФ и рибозо-5-фосфата при проведении реакции является 33 мМ, поэтому на 60 мл инкубационной смеси берут 2 ммоля рибозо-5-фосфата и 2 ммоля АТФ.

2 ммоля рибозо-5-фосфата бария (навеска 840 мг с учетом содержания в препарате 15% гигроскопической воды) растворяют в 10 мл охлажденной до 0°С 0,1 н. соляной кислоты и добавляют 2 ммоля (284 мг безводной соли) сульфата натрия, осадок BaSO4 удаляют центрифугированием.

2 ммоля АТФ, натриевая соль (навеска 1102 мг растворяется в 10 мл перегнанной и.ч стекла воды.

Для приготовления инкубационной смеси к 5 мл раствора, содержащего MgCb и дитиотреитол, прибавляют 10 мл раствора рибозо-5-фосфата и 10 мл раствора АТФ,

доводят рН смеси до 7,5-7,8 сухим трисбуфером, прибавляют биокатализатор: 10-30 мл элюата, собранного с колонки с сефадексом G-25 (50-100 эдг белка) или 20-35 мл супернатанта 23000 g (100-

200 мг белка) и доводят общий объем смеси до 60 мл 50 мМ трис-НС1 буфером рН 7,5-7,8.

Инкубацию проводят при 35-38°С

30 мин, значительного изменения рН не наблюдается. Затем ферментную смесь охлаждают до 4°С, прибавляют 5 мл 50%ной трихлоруксусной кислоты и осадок белка удаляют центрифугированием при

1000 g 10 мин. Для очистки Е)-рибулозо-1,5дифосфата к супернатанту добавляют 30 г активированного угля марки БАУ, предварительно промытого 1 н. НС1, затем 10%ной трихлоруксусной кислотой и водой до

нейтральной реакции. Уголь отделяют на воронке Бюхнера с отсасыванием и промывают его 4-5 раз водой по 100 мл. Опытный раствор и промывные воды объединяют, нейтрализуют до рН 6,0 бикарбонатом натрия и осаждают бариевую соль О-рибулозо-1,5-дифосфата прибавлением равного объема 96%-ного танола, охлажденного до 4°С, и 4 мл 1 М уксуснокислого бария. Через 1 ч стояния при 4°С осадок

отделяют центрифугированием при 1000 g 10 мин. Выход бариевой соли 1000 мг CsHgOiiPsBas мол. вес. 580. Далее растворяют в 17-20 мл 0,02 н. НС1 (в минимальном объеме) и прибавляют 4 ммоля

(568 мг безводной соли) сульфата натрия. Осадок сульфата бария удаляют центрифугированием при 1000 g 10 мин, а супернатант нейтрализуют бикарбонатом натрия до рН 6,0, добавляют к нему 96%-ныйэтиловый спирт до 80 об. % и раствор лиофилизируют. Выход лиофилизироваиного препарата натриевой соли О-рибулозо-1,5-дифосфата C5H80 iP2Na4, мол. вес. 398- 600 мг, что соответствует 75% от теоретического.

Для проверки способности D-рибулозо1,5-дифосфата акцептировать углекислоту использовали ферментную смесь, содержащую 10 мМ хлористого магния, 10 мМ

ДДТ, 40 мМ меченого по углероду бикарбоната натрия (), 0,44 мкМ рибулозодифосфаткарбоксилазы из бобов (0,2 мг белка на 1 мл ферментной смеси).

Данные по выходу, содержанию фосфора и ферментной активности (по количеству акцептированной за 1 мин меченой С углекислоты) приведены ниже. В контроле (без рибулозодифосфата) радиоактивность

100 НМЛ/мин.

Выход препарата, мг (% от теоретического)

Содержание фосфора:

0-Рибулозо-105-дифосфата (щелочелабильный)

Минеральный

Неизвестный

Радиоактивность, имп/м н, при концентрации D-рибулозо-1 5-дифосфата, мМ;

0,5

1,0

1,5

2,0

3,0

4,0

Хроматография полученного препарата на бумаге в системе растворителей н-бутанол, уксусная кислота, вода 74 : 19 : 50 показала незначительное содержание неорганического фосфора.

Производство 0-рибулозо-1,5-дифосфата по предлагаемому способу обеспечивает низкую себестоимость препарата: себестоимость 600 мг препарата равна 22 руб. 58 коп., 100 мг-3 руб. 77 коп.

Формула изобретения

Способ получения О-рибулозо-1,5-дифосфата из рибозо-5-фосфата и аденозинтрифосфата в присутствии ионов и трисбуфера с использованием биокатализатора с последующим выделением целевого продукта путем добавления к ферментной системе, охлажденной до 4-5°С, трихлоруксусной кислоты, удаления образовавшегося осадка, обработки раствора активированным углем и прибавления к очищенному от активированного угля раствору уксуснокислого бария и этилового спирта, отличающ и и с я тем, что, с целью упрощения процесса и увеличения выхода целевого продукта, в качестве биокатализатора используют ферментный препарат из листьев бобов Vicia Faba L., полученный из водного экстракта гомогената листьев путем осаждения при 50%-ном насыщении сульфатом аммония с последующим обессоливанием на колонках с сефадексом и процесс проводят на воздухе при 35-38°С, а этиловый спирт добавляют до конечной концентрации его в растворе 50-60 об. %.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Авторское свидетельство СССР JVfo 309610, кл. С 12D 13/10, заявлено 28.11.69 (прототип).