СПОСОБ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ИММУНОФЛЮОРЕСЦЕНТНЫХ Советский патент 1973 года по МПК G01N1/30 A61B6/00 

1

Изобретение относится к области медицины. Известен способ приготовления иммунофлюоресцентных препаратов, заключающийся в том, что в исследуемые объекты вводят радиоактивную метку с последующей фиксацией в ацетоне, промывкой, очисткой от радиоактивных примесей, сущкой, нанесением на препарат иммунной сыворотки, исследованием препарата в люминесцентном микроскопе, определением локализации и количества антигенов с последующим покрытием препарата светочуЕь ствительной фотопленкой и выявлением химических компонентов, известными и применяемыми при радиоавтографических методах исследования.

Однако этот способ не позволяет одновременно исследовать локализацию и количество антигенов и химических компонентов в одной и той же структуре.

В предлагаемом способе в отличие от известных фиксацию объекта проводят в спиртуксусной кислоте с последующим нанесением светочувствительной эмульсии в концентрации 1 :2, выдерживании с ней препарата и нанесением иммунной сыворотки после проявления и обработки на 60 мин при 37°С.

Пример. В качестве модели используют перевиваемые культуры клеток почек сирийского хомяка, выращенные на покровных стеклах и зараженные вирусами Астра и Ибадан.

Через трое суток после заралсения в культуральную жидкость добавляют предшественник

РНК уридин И в дозе 5|iC на 1 мл на 24 час.

Через 24 час культуры отмывают от среды

физиологическим раствором и фиксируют смесью спирт-уксусной кислоты (3:1) в течение 15-20 мин, затем промывают в 70-градусном спирте 5 мин и помещают в 3%-ную хлорную кислоту на 20 мин при 4°С. После

этого препараты отмывают в проточной воде и нескольких порциях дистиллированной вол.ы 40 мин и сущат.

Покровные стекла наклеивают канадским бальзамом на предметные стекла культурой

вверх. Необходимость в этом отпадает при выращивании культуры на предметных стеклах. Препараты покрывают тонким слоем разведенной 1 :2 светочувствительной эмульсией типа М нри 42°С (светофильтр желто-зеленый

117 или 118) и помещают в герметизированные лейкопластырем светонепроницаемые ящики в холодильник при 4°С на 5 суток до появления нужного количества зерен серебра. Затем препараты проявляют в амидоловом

проявителе для авторадиографии 2,5 мин при 18°С, промывают 1 мин дистиллированной водой, фиксируют 30%-ным раствором гипосульфита 10 мин, промывают в проточной воде 60 мин и споласкивают в дистиллированной

воде. На препараты, помещенные в влажные

камеры, наносят меченую изотиоцианатом флюоресцеина иммунную сыворотку на 40 - 60 мин нрн 37°С, после чего препараты промывают в нескольких порциях забуференного физиологического раствора (рН 7,2-7,4) в течение 15-20 жын, споласкивают дистиллированной водой и подсушивают.

Лезвием бритвы осторожно отделяют препарат - покровное стекло, протирают нижнюю часть ксилолом или бензолом для удаления бальзама и осторожно небольшой каплей бальзама (илп подходяш;его клея) подклеивают с одного края препарат на чистое предметное стекло, чтобы бальзам не растекся, так как он сильно флюоресцирует. Необходимость в этом отпадает при вырашивании культур на предметных стеклах.

Препараты просматривают в люминесцентном микроскопе без покровных стекол, не заключая в забуференный глицерин. Места синтеза РНК учитывают по черным зернам серебра, которые можно подсчитать, меняя глубину фокуса микровинтом.

Места локализации антигена в ядрах и цитоплазме клеток на том же препарате учитывают по яркой зеленой флюоресценции. При предлагаемом способе ргммунофлюоресценция не нарушаётся ни слоем фотоэмульсии, ни скоплениями зерен серебра.

Предмет изобретен-и я

Способ приготовления иммунофлюорёсЦеНтных препаратов путем введения в исследуемые

объекты радиоактивной метки с последуйшей фиксацией, промывкой, покрытием свёточувствительным материалом, очисткой от радиоактивных примесей, проявлением сушкой с последуюшим нанесением сыворотки для исследования в люминесцентном микроскопе, отличающийся тем, что, с Целью одновременного исследования локализации и количестёа в одной и той же структуре антигенов и химических компонентов, фиксацию объекта проводят в спирт-уксусной кислоте с последующим нанесением светочувствительной эмульсии в концентрации 1 :2, выдерживании с ней препарата и найесейием иммунной сывороФКн после проявления и обработки на 60 мин при

37°С.