СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ХОЛИНА В БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТАХ Советский патент 1973 года по МПК B01D15/08 

1

Изобретение относится к области животноводства.

Известный способ определения холина в биологических объектах, включающий размельчение исследуемой ткани, гидролиз фосфатидов, отделение холина на бумаге методом хроматографии и его количественное определение имеет существенный недостаток - на гидролиз холинфосфатидов 6N соляной кислотой затрачивается 48 час, а для приготовления подвижной фазы н-бутанол-диэтиленгликоль-вода требуются дефицитные химические реактивы.

С целью сокращения времени гидролиза и повышения точности определения по предлагаемому способу гидролиз фосфатидов производят насыщенным раствором гидрата окиси бария, а для отделения холина используют подвижную фазу н-бутанол-уксусная кислота-вода, в соотнощении 144 : 13 : 43. При этом количество холина определяют элюацией проявленных фосфомолибдатом пятен холина смесью метанол-уксусная кислота, в соотнощении 4:1, а при калориметрировании к элюату добавляют 0,5 мл 0,4%-ного хлористого олова в 3N соляной кислоте.

Предлагаемый способ определения холина в биологических объектах заключается в следующем.

Анализируемую ткань в количестве 10 г гомогенизируют (для мучнистых кормов животного происхождения эту операцию не производят), экстрагируют три раза по 30 мин смеСЬЮ хлороформ-этанол (2 : 1), чтобы отнощение общего объема экстрагирующей смеси к весу ткани составляло 20 : 1. Затем экстракт выпаривают досуха при пониженном давлении на водяной бане, к остатку добавляют 30 мл

насыщенного раствора гидрата окиси бария и проводят гидролиз в кинящей водяной бане в течение 2 час. Охлажденную после гидролиза смесь нейтрализуют 20%-ным раствором уксусной кислоты но фенолфталеину, фильтруют

для отделения жирных кислот и выпаривают снова досуха. Осадок растворяют в 0,5-1 мл соляной кислоты рН-1, переносят в конические пробирки и при необходимости центрифугируют.

На линию старта в 2,5 см от нижнего края листа хроматографической бумаги (18x50) микропипеткой наносят но 0,01-0,02 мл растворы образцов и холив-хлорида - «свидетеля - в виде пятен диаметром 0,5-1 см на

расстоянии 4 см друг от друга. Нанесенные пробы на бумагу подсушивают в токе холодного воздуха при помощи фена. Бумагу помещают в камеру и проводят хроматографирование в течение 24 час восходящим способом,

применяя подвижную фазу: н-бутанол-уксуспая кислота-вода (144: 13:43), которую иалнаают за 1 час до начала работы.

Хроматограмму вынимают из камеры, сушат 30 мин при комнатной температуре и 20 мин при 100°С в термостате. Затем быстро ее погружают в 2%-ный раствор фосфомолибденовой кислоты на 1 мин, после чего промывают в проточной воде 5 мин и высушивают при комнатной температуре. Окрашенные в желтый цвет пятна обводят карандашом, вырезают, измельчают ножницами и элюируют 5 мл смеси метанюл : уксусная кислота (4:1) в течение 1 час при 37°С три раза (1-й раз - 1,5 мл; 2-й- 1,5 мл; 3-й - 2 мл). После каждой элюации пробирки центрифугируют и элюаты объединяют. К элюату добавляют 0,5 мл 0,4%-ного раствора хлористого олова в 3,N соляной кислоте, доводят объем до 5 мл элюируюш,ей смесью и измеряют оптическую плотность при 350-360 ммк на ФЭКе с рабочей длиной кюветы 10 мм. Рассчитывают концентрацию холина по калибровочной кривой, построенной путем хроматографирования различных количеств холин-хлорида, рабочий раствор которого содержит 10 мг стандарта в 1 мл.

Для качественной оценки холина хроматограмму после обработки раствором фосфомолибденовой кислоты и промывания слегка протягивают через свежеприготовленный 0,4%ный раствор хлористого олова в 3N соляной кислоте. Проявленные пятна имеют темно-синий цвет с четкими границами на голубоватом фоне (,3).

При размерах камеры 55x25x20 анализируют одновременно 15-20 образцов в течение 30 час.

Ошибка метода + 5%.

Предмет изобретения

1.Способ определения холина в биологических объектах, включаюш,ий размельчение исследуемой ткани, гидролиз фосфатидов, отделение холина на бумаге методом хроматографии и его количественное определение, отличающийся тем, что, с целью сокращения времени гидролиза и повышения точности определения, гидролиз фосфатидов производят васыщенным раствором гидрата окиси бария, а для отделения холина используют подвижную фазу н-бутанол-уксусная кислота-вода, в соотношении 144 : 13 : 43.

2.Способ по п. 1, отличающийся тем, что количество холина определяют элюацией проявленных фосфомолибдатом пятен холина смесью метанол-уксусная кислота, в соотношении 4 : 1, а при колориметрировании к элюату добавляют 0,5 мл 0,4%-ного хлористого

олова в 3 N соляной кислоте.