СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБИОТИКА Советский патент 1974 года по МПК A61K38/23 C07G11/00 C12R1/09 

Изобретение относится к области микробиологии, а именно к микробиологическим сиособам получения антибиотиков.

Известен способ получения антибиотика путем культивирования Bacillus circulans в аэробных условиях в водной питательной среде, содержащей источник углеводорода, азота и минеральные соли, с последующим выделением целевого продукта из фильтрата культуральной жидкости и хроматографическим разделением его на активные компоненты.

Предлагаемым способом антибиотик получают путем культивирования щтамма микроорганизма Bacillus circulans АТСС 21656 в аэробных условиях в водной питательной среде, содержащей источник усвояемого углерода, азота и минеральные соли, до накопления в культуральной жидкости значительной активности антибиотика.

Затем культуральную жидкость подкисляют, выпавщий осадок отделяют фильтрованием и промывают водой. Фильтрат и промывные воды объединяют и экстрагируют спиртом, смещивающимся с водой, предпочтительно н-бутанолом. Спиртовой раствор концентрируют, и антибиотик осаждают этилацетатом ацетонитрилом, эфиром или ацетоном. Продукт можно затем подвергать более тщательной очистке распределением в системе,

содержащей воду, спирт и органическую кислоту, например, н-пропанол, н-бутанол, воду и уксусную кислоту, или образованием соли гелиаптовой кислоты и регенерацией антибиотика из этой соли.

Этот процесс приводит к выделению антибиотика ЕМ-49 в виде соли с кислотой, соответствующей кислоте, применяемой для подкисления бульона. Соль превращают в свободное основание нейтрализацией, водным раствором аммиака, гидроокисью натрия, гидроокисью бария, и экстрагированием н-бутанолом. Полученный таким образом антибиотик

ЕМ-49 представляет собой вещество с антимикробной активностью. При более тщательном разделении антибиотик можно разделить на четыре активные фракции, близкие по структуре друг другу, и пятую фракцию, содержащую активное вещество неопределенной структуры.

Все ИК-спектры сняты в КВг, а ЯМРспектры - в диметилсульфоксиде de.

На фиг. 1 изображен ИК-спектр антибиотика ЕМ-49 в виде хлоргидрата; на фиг. 2 - ЯМР-спектр хлоргидрата антибиотика ЕМ-49 на фиг. 3 - ИК-спектр антибиотика ЕМ-49; на фиг. 4 - ЯМР-спектр антибиотика ЕМ-49:

на фиг. 5-9 ИК-спектры антибиотика ЕМ-49

альфа, бета, гамма, дельта и МПФ соответственно.

Антибиотик ЕМ-49 и фракция, полученные при его разделении, активны по отношению к грибкам, а также к грам-положительным и грам-отрицательным бактериям, например, видов Staphylococcus aureus. Streptococcus pyogenes, Pseudomonas aeruginosa, Esherichia coli и Candida albicans.

Поэтому антибиотик или его физиологически приемлемую соль с кислотой можно применять в качестве противомикробного средства либо для дезинфекции окружающей среды, например, в ф|0рмах для разбрызгивания или распыления, содержащих примерно по 1 % вещества в обычно применяемом носителе, либо для борьбы с инфекциями, поражающими различные виды животных, вызванные вышеуказанными микроорганизмами, например при нанесении в виде мазей, содержащих до 1 % вещества, или в виде инъекций в дозировке 50-125 мг/кг веса в день. Доза ЕД50 для мышей для борьбы с инфекцией, вызванной Esherichia coli, составляет примерно 50 мг/кг веса. Штамм Bacillus circulans - продуцент антибиотика ЕМ-49, выделен из почвы и хранится в коллекции культур в США.

Морфолого-культуральные свойства. Спорообразующие бациллы грамм-отрицательные. Споры расположены центрально или субцентрально, овальные; стенки опор толстые и легко окрашиваются; спорангии отчетливо набухают. Палочки не образуют цепочек. Мазки, окрашенные 0,5% основным раствором фуксина, показывают наличие тонкой оболочки. Колонии на питательном огаре, содержащем глюкозу, блестящие с гладкими или неровными краями, очень клейкие, слизистые, подвижные, легко размазываются на поверхности агара особенно при увлажнении чашек.

В питательном бульоне наблюдается мутность, тяжелый осадок, тонкая слизистая плеика.

Физиологические свойства. Испытания по Воже - Проскауэру на образование ацетилметилкарбинола отрицательные. Культура индол не образует, крахмал (казеин) гидрализует газ из углеводов ие образуется. Не растет при 60-65°С.

Получение антибиотика

Штамм Bacillus circulans АТСС 21656 продуцирует антибиотика, обладающий активностью против грам-положительных и грамотрицательных бактерий, а также грибков типа Candida albicans. Для получения антибиотика штамм Bacillus circulans АТСС 21656 выращивают в аэробных условиях в водной питатель среде, содержащей усвояемый углевод и источник азота. Ферментацию проводят в течение 60-150 час, предпочтительно 144 час, затем образуется антибиотик.

После завершения ферментации культуральную жидкость подкисляют до рН 2 концентрированной соляной кислотой, добавляют осадитель, и всю суспензию фильтруют. Осадок промывают большим количеством воды, и промывные воды соединяют с фильтратом. Промытый осадок отбрасывают. Фильтрат вместе с промывными водами экстрагируют н-бутанолом, насыщенным водой. Бутанольный экстракт концентрируют под вакуумом при температуре ниже 45°С до небольшого

объема. Концентрат затем разбавляют 15 об. ч. ацетона. Полученный осадок промывают ацетоном, этилацетатом и эфиром и получают после высущивания светло-бурый порошок. Антибиотик, содержащийся в этом

неочищенном препарате, подвергают последующей очистке противоточным распределением с применением системы, содержащей н-пропанол, н-бутанол, воду и уксусную кислоту в соотношении по объему 50 : 75 : 100 : 2.

Материал, полученный после 29 операций противоточного распределения, применяют для характеристики антибиотика.

Антибиотик ЕМ-49 представляет собой пептид основного характера, образующий соли с

неорганическими и органическими кислотами. При подкислении культуральной жидкости соляной кислотой получают хлоргидрат. При использовании других кислот, например неорганических, типа бромистоводородиой кислоты, серной кислоты можно получать соответствующие соли этих кислот. Образующуюся соль, в виде которой сначала получают антибиотик, можно нейтрализовать основанием, например гидроокисью натрия, с получением свободного основания. Соли, не растворимые в воде, например арилсульфокислоты, типа нафталин-2-сульфокислоты, метилоранжа, н-фенизазобензосульфокислоты, могут быть образованы реакцией кислой соли антибиотика ЕМ-49, например его хлоргидрата, с солью щелочного металла арилсульфокислоты.

Особенно рекомендуемым способом выделения антибиотика ЕМ-49 является способ с

применением соли гелиаитовой кислоты. Светло-бурый порошок, полученный осаждением ацетоном из концентрата, обрабатывают водным раствором метилоранжа, полученным осаждением соли гелиантовой кислоты антибиотика ЕМ-49. Гелиантат, представляющий собой аморфный порошок, в этом состоянии, подвергают очистке повторным осаждением из диметилформамида, смеси метанола и ацетонитрила и из подобных растворителей. Обработка соляной кислотой способствует повторному превращению гелиантата в хлоргидрат.

Светло-бурый порошок, не растворимый в ацетоне, содержит антибиотик ЕМ-49. Порошок подвергают очистке. Очищенный порошок содержит близкие по строению антибиотики со структурой пептидов и характеризующиеся наличием четырех свободных аминогрупп, которые можно разделить с применением ионообменной хроматографии.

В том случае, когда водный раствор хлоргидрата антибиотика ЕМ.-49, полученный через соль гелиантовой кислоты подвергают хроматографии на колонне, заполненной карбоксиметилцеллюлозой в виде натриевой формы (например, «Ватман целлюлоза СМ-52) и элюируют разбавленным раствором хлористого натрия, антибиотик разделяют на четыре фракции в зависимости от поверхностного натяжения вытекающего потока. Эти фракции обозначаются соответственно ЕМ-49 альфа, бета гамма и дельта в порядке проведения их элюирования. Некоторые фракции различаются по их аминокислотному составу и по различиям в структуре остатка жирной кислоты. Анализ аминокислот показал, что фракции ЕМ-49 альфа и бета не содержат фенилаланина, содержат пять остатков 2,4- диаминомасляной кислоты и три остатка лейцина. Фракции ЕМ-49 гамма и дельта содержат один остаток феиилаланина, два остатка лейцина и пять остатков 2,4-диаминомасляной кислоты. Фракции ЕМ-49 альфа и бета отличаются друг от друга по структуре жирных кислот, выделяюидихся после гидролиза в кислой среде. Аналогично отличаются друг от друга фракции ЕМ-49 гамма и дельта.

Хроматография не растворимого в ацетоне порошка в некоторых системах показала малоподвижную фракцию (МПФ), обладающую также щироким спектром антимикробного действия. Эту фракцию выделяют и подвергают очистке экстрагированием и-бутанолом с последующей хроматографией на диэтиламиноэтнлцеллюлозе и повторной распределительной хроматографией на колонне, заполненной кремниевой кислотой и целлюлозой, элюированием смесью, содержащей н-бутанол, изомасляную кислоту, пиридин и воду (40 : 9 : :4:10). Фракцию антибиотика БМ-49 МПФ можно также выделить и очистить путем хроматографии порощка, не растворимого в адетоне, на «Сефадекс LH20 (алкилированный сшитый декстран) с элюированием метанолом. Фракцию МГ можно легко выделять посредством образования кристаллической соли Рейнеке, получаемую в виде ярко-красных кристаллов.

Пример 1. Дрожжевомясной косой агар засевают микроорганизмом штамма Bacillus circulans АТСС 21656. Культуру выдерживают в термостате в течение ночи при 37°С, а затем смывают 50 мл водной среды из соевой муки в колбы Эрленмейера емкостью 250 мл. Состав ростовой среды, г:

Соевая мука15,0

Обезвоженный измельченный

картофель15,0

Глюкоза- 50,0

CoCl2-2H2O0,005

СаСОз10,0

Дистиллированная вода до1000 мл.

Среду стерилизуют в течение 30 мин при 121°С и иаром под давлением 1,55 кг/см перед ее использованием. Посеянную культуру выращивают при 25°С в течение 72 час при постоянном перемешивании на ротационной мешалке (280 об/мин) и при перемещении

склянки на два дюйма (5,08 см).

Из каждой колбы отбирают пипеткой по 2,5 об. % культуральной жидкости в колбу Эрленмейера, содержащую 100 мл жидкой питательной среды (рН 7,0) следующего состава, г:

Жидкий кукурузный экстракт 6,0

(NH4)H2P043,0

Дрожжевой экстракт2,5

Декстроза10,0

СаСОз2,5

Дистиллированная водадо 1000 мл.

Колбы выдерживают в тех же условиях. Образцы отбирают через 3 и 6 дней и изучают с применением бумажной хроматографии и биоаиализа. Для бумажной хроматографии подходящее количество бутанольного экстракта подкисленной ферментативной жидкости наносят на листы бумаги «Ватман Г,

и хроматограмму проявляют растворителем следующего состава: н-бутанол, уксусная кислота, вода 4:1:5 (по объему). Верхнюю фазу этой системы используют в качестве растворителя.

Антибиотик ЕМ-29 (в виде хлоргидрата) имеет величину Rf 0,71. Антибиотик определяют биологически по отношению к штаммам микроорганизмов Staphylococcus aureus ГДА 209Р и Esherichia coli АТСС 10536. Для

биоаиализа эти штаммы микроорганизмов применяют обычным образом с использованием пробирок с различной степенью разбавления. Пример 2. 250 литров культуры микроорганизма штамма Bacillus circulans АТСС

21656 подвергают ферментации в аппарате из

нержавеющей стали емкостью в 100 галлонов

(378,5 л) средой в условиях, описанных ниже.

Стадия 1.

Инокулюм. Культуру микроорганизма штамма Bacillus circulans АТСС 21656 сохраняют в жидком азоте, выращивают на дрожжевомясном косом агаре следующего состава, г:

Мясной экстракт1,5

Дрожжевой экстракт3,0

Пептон6,0

Декстроза1,0

Агар15,0

Дистиллированная вода до1000 мл.

Среду стерилизуют под давлением 1,55 кг/см, при 121°С за 15 мин перед применением.

Ростовую среду из косого агара применяют для инокуляции первых колб для роста. Состав среды, г:

Соевая мука15,0

Обезвоженный измельченный картофель15,0

Глюкоза50,0 CoCl2-2H2O0,005

СаСОз10,0

Дистиллированная вода до1000 мл.

Стерилизацию проводят при 121°С в течение 30 мин.

100 мл этой среды, помещенной в колбу Эрлейнмейера, выдерживают в течение 72 час на роторной мешалке при 25°С. Мешалка работает со скоростью 280 об/мин, давая перемеш,ение склянки 5,08 см.

Стадия 2.

Инокулюм: 100 мл материала из первой стадии.

Среда такая же, как ростовая среда на стадии I. Инокулируемый материал и 1000 мл среды в колбе Эрленмейера емкостью 4000 мл прививают в течение 72 час при 25°С на роторной мешалке (280 об/мин), перемеш,ая склянку на 5,08 см.

Стадия 3.

Инокулюм: 3000 мл материала из второй стадии.

Применяют среду (рН 7,0) следующего состава, г:

Кукурузный экстракт (жидкий) 6,0

(NH4)H2PO43,0

Дрожжевой экстракт2,5

Декстроза10,0

СаСОз2,5

Дистиллированная водадо 100 мл.

Инокулированный материал добавляют к 250 л среды и выдерживают при постоянных условиях в течение 144 час при аэрации со скоростью 0,61 мл/мин цод давлением 0,7 кг/см и перемешивании со скоростью 155 об/мин (0,4 вт/л).

.Пример 3. Культуральную жидкость, полученную по методике, описанной в примере 2 (209 л), подкисляют до рН 2,0 1,5 л концентрированной соляной кислоты и добавляют фильтрующее средство («Гифло, 15 кг). Смесь фильтруют с образованием 41 кг нерастворимого материала. Нерастворимый осадок на фильтре промывают 10 л воды, и промывные воды соединяют с фильтратом с образованием 190 л жидкости. Промытый мокрый осадок на фильтре (41 кг) отбрасывают.

Пример 4. Фильтрат (190 л), полученный ио методике, описанной в примере 3, экстрагируют трижды 56 л н-бутанола, насыщенного водой. Бутанольные слои (194 л) собирают и концентрируют под вакуумом при 45°С до небольшого объема (2,3 л).

Пример 5. 50 мл концентрата, полученного по методике, описанной в примере 4, разбавляют 750 мл ацетона и центрифугируют. Осадок промывают ацетоном (60 мл), суспендированием его в растворителе, а затем центрифугируют. Операцию повторяют с применением этилацетата (трижды по 60 мл) и эфира (трижды по 60 мл). Осадок высушивают на воздухе, измельчают и высушивают под

вакуумом. Получают 1,4 г светло-бурого порошка.

Пример 6. 1,4 г образца, не растворимого в ацетоне, полученного по методике, описанной в примере 5, подвергают последующей очистке противоточным распределением с использованием системы, содержащей н-пропанол, н-бутанол, воду и уксусную кислоту (50:75: 100:2 по объему). Проводят 29 переносов по 40 мл каждой фазы на пробирку. Максимальная активность, определяемая диффузией с применением бумажных дисков, наблюдается в пробирке 11. Содержимое пробирок 8-14 соединяют, и растворители удаляют под вакуумом. Остаток растворяют в небольшом количестве метанола и осаждают антибиотик путем добавления ацетона и эфира. Осадок тщательно промывают эфиром, высушивают на воздухе, а затем под вакуумом и получают 0,466 г светло-бурого порошка. Этот порошок представляет собой преимущественно основной антибиотик ЕМ-49 пептидного характера в виде хлористоводородной соли.

Найдено, %: С 45,58; Н 7,31; N 14,62; С1 11,86 (ионный); (,0, вода); -42+3° (589 ммк); --44° (578 ммк); -50° (546 ммк); -91° (436 ммк).

ИК-спектр поглощения для хлоргидрата изображен на фиг. 1; ЯМР-спектр для хлоргидрата в диметилсульфоксиде de - на фиг. 2.

Для определения антибиотика применяют бумажную хроматографию (фильтровальная бумага марки «Ватман 1), а также биологический анализ с применением Е. соИ АТСС 10536.

Система растворителей н-бутанол : уксусная кислота : вода (4:1:5)0,71

н-пропанол : н-бутанол : вода

(2:3:4)0,57

Хлороформ : метанол : вода (5:4:2) 0,38 Хлороформ : метанол : 1%-ная уксусная кислота (5:4:2)0,35

Хлороформ : метанол : 0,5 н. NH4OH (5:4:2)0,91

Хлоргидрат антибиотика ЕМ-49 имеет температуру плавления 180-207°С (с разложением), растворим в воде, метаноле, этаноле, диметилсульфоксиде и уксусной кислоте, не растворим в ацетоне, этилацетате, эфире и ацетонитриле.

Продукт гидролиза образца (2,30 мг) хлоргидрата антибиотика ЕМ-49, продуцируемого по описанной методике, получают нагреванием этого антибиотика в 6 н. растворе соляной кислоты при 110°С в течение 16 час.

Анализ по известному способу Штейна- Мура показал присутствие лейцина (3,95 моль) и 2,4-диаминомасляной кислоты (7,35 мкмоль). В продукте гидролиза обнаружен также фенилаланин (0,86 мкмоль), а

также следы других аминокислот. Продукт

содержит идентифицируемое количество треонина, что служит для отличия антибиотика ЕМ-49 от других антибиотиков пептидного характера, например, циркулина, полимиксинов и полипептина. Из продукта гидролиза можно выделить неидентифицированную жирную кислоту, что показывает присутствие примерно 10 вес. % этой кислоты в антибиотике. Спектр ультрафиолетового поглощения хлоргидрата в 0,05 н. растворе соляной кислоты показывает наличие небольшого пика при 248 ммк (Е 25) и конечную адсорбцию. Интенсивность адсорбции при 248 ммк усиливается окрашенными примесями, что дает повышение пика поглощения также и в видимой области спектра. Этот пик и конечная адсорбция являются (по крайней мере частично) следствием наличия фенилаланина.

Пример 7. Хлоргидрат антибиотика ЕМ-49 превращают в свободное основание противоточным распределением с применением системы, содержащей н-бутанол и 0,5 мл раствор Н4ОН 1,01 г хлоргидрата антибиотика ЕМ-49, полученного по методике, описанной в примере 6, подвергают 29-кратному переносу с применением 40 мл верхней и нижней фазы в пробирку. Содержимое пробирок 25-29 соединяют, верхнюю фазу отделяют и упаривают досуха под вакуумом. Остаток затем растворяют в теплом метаноле (примерно 50 мл). Добавляют этилацетат (50 мл), бензол (50 мл) и циклогексан (50 мл). Удаляют эту смесь растворителей под вакуумом и получают 0,75 г беловатого порошка, представляющего собой свободное основание антибиотика ЕМ-49. Температура плавления полученного антибиотика 245-248°С. Найдено, %: С 56,64; Н 8,65; N 16,50; С1 0,0.

Молекулярный вес свободного основания определяют в этаноле посредством ультрацентрифугирования. Он составляет примерно 1080. Эквивалентный вес, определяемый титрованием хлорной кислотой, составляет 272. Эмпирическая формула антибиотика ЕМ-49 в виде свободного основания соответствует примерно CsiHgsNlsOig.

Спектр ультрафиолетового поглощения, определяемый в метаноле, имеет дополнительно к сильному концевому поглощению следующие пики.

Ямакс (), ммк;

247,5 (плато, 5,8), 252 (плато, 4,5), 258 (4,1), 265 (3,4), 268 (3,2).

ИК-спектр в КВг изображен на фиг. 3. ЯМР-спектр в диметилсульфоксиде de - на фиг. 4.

Раствор хлоргидрата антибиотика ЕМ-49 в воде (0,1 -10 мг/мл) обрабатывают растворами солей натрия и калия (0,5 мл). Соли следующих анионов не образуют осадка: ОАс- НРО42-, J- СЮз-, С2О42-, ВгВ4О7, JOs-. Следующие анионы образуют осадки в возрастающей степени растворимости: SO42-, МоО42- НРО42-, , Fe (СЫ)б-, Fe (СЫ)б СггОу -

Пример 8. Антибиотик ЕМ-49 можно также осаждать из водного раствора в виде соли с различными арилсульфокислотами путем обработки кислотой или соль кислоты. 1,00 г хлоргидрата антибиотика ЕМ-49 растворяют в 50 мл воды и добавляют раствор 1,25 г п-фенилазобензолсульфокислоты в 20 мл воды. Смесь перемешивают в течение 30 мин и выдерживают для отстаивания.

Верхний слой декантируют и осадок промьгвают дважды по 30 мл воды, а затем фильтруют. Осадок высушивают под вакуумом и получают 1,43 г аморфного твердого вещества. Полученную твердую соль п-фенилбензолсульфокислоты кристаллизуют из метанола. Образец перекристаллизовывают 4 раза из смеси метанола с ацетонитрилом (2:1) и получают продукт, разлагающийся при температуре примерно 267°С при быстром нагреваНИИ под вакуумом. Полученный продукт высушивают в течение нескольких часов под давлением 0,02 мм рт. ст. и 100°С и получают повышение веса на 4,17% за счет атмосферной влаги.

Найдено, %: С 53,29; Н 6,42; N 13,10; О 21,33 (по разнице); S 5,86.

Для молекулярного веса 2103 (определенного исходя из наличия четырех атомов серы) анализ соответствует формуле C97Hi3oN2iO2.iS4.

Пример 9. Смесь 130,8 мг хлоргидрата антибиотика ЕМ-49, 1 мл н-бутанола, 1 мл метилэтилкетона, 0,2 мл 1 М раствора 2,4 динитрофторбензола в толуоле и 2 мл 10% раствора бикарбоната натрия перемешивают при

комнатной температуре в течение 1,7 час. Верхнюю фазу отделяют, а нижнюю фазу промывают несколько раз этилацетатом. Соединяют верхние фазы, а промывные жидкости и растворители удаляют под вакуумом. Остаток растворяют в минимальном количестве метилкетона, осадок удаляют центрифугированием и отбрасывают. Верхний слой обрабатывают досуха в потоке азота. Остаток растворяют в небольшом количестве ацетона,

и продукт осаждают добавлением бензола. Твердое 2,4-динитрофенилпроизводное промывают несколько раз бензолом и высушивают под вакуумом. Получают 36,1 мг желтого порошка. Анализ с использованием тонкопленочной хроматографии на силикагеле после элюирования смесью метанола с хлороформом (1:9) дает одно чистое пятно (Rf 0,51). Материал подвергают очистке с применением тонкослойной хроматографии и такой же системы растворителей. Собирают желтую ленту с величиной Rf 0,52-0,68. Продукт вымывают из силикагеля смесью ацетона и метанола (1:1) и превращают в порошкообразное состояние (30,4 мг) осаждением из ацетонового раствора бензолом. УФ-спектр поглощения в метилэтилкетоне дает Хмакс 352 ммк, . Образец высушивают при 100°С и давлении 0,02 мм рт. ст. и доводят до постоянного веса атмосферной влагой.

И

Найдено, %: НгО 1,04; С 52,02; Н 6,13; N 16,61; О 25,24% (по разнице). Для молекулярного веса 1744 это соответствует эмпирической формуле CreHiosNgiOj Пример 10. 1,00 г порошка, не растворимого в ацетоне, полученного по методике, описанной в примере 5, растворяют в 10 мл воды. Нерастворимую часть удаляют центрифугированием, промывают 10 мл воды и промывные жидкости соединяют.

1,00 г метилоранжа суспендируют в 15 мл воды. Добавляют 5 мл диметилформамида, и смесь нагревают до растворения метилоранжа. Этот теплый раствор добавляют к раствору антибиотика ЕМ-49. Смесь охлаждают до комнатной температуры, и осадок выделяют центрифугированием, промывают трижды по 35 мл воды и высушивают под вакуумом.

Неочищенный гелиантат растворяют в 3 мл диметилформамида и нерастворившуюся часть удаляют центрифугированием, промывая ее дважды по 3 мл диметилформамида. Соединенные растворы диметилформамида соединяют с 90 мл воды, осадок выделяют центрифугированием и промывают трижды по 30 мл воды.

Гелиантат антибиотика ЕМ-49 представляет собой аморфное вещество, которое можно очистить перекристаллизацией из смеси метанола с ацетонитрилом (2: 1). Полученный продукт высушивают под давлением 0,02 мм рт. ст. и 100°С в течение 18 час, а затем доводят до постоянного веса атмосферной влагой. Температура плавления в горячем состоянии по Кофлеру: 242-244°С (с разложением).

Найдено, %: С 53,01; Н 6,74; N 14,19; S 5,44 (вода 5,05%). Для молекулярного веса 2238 элементарный анализ соответствует

эмпирической формуле Cio4Hi44N24O24S4.

Гелиантат антибиотика ЕМ-49 превращают в хлоргидрат перемешиванием с 10 мл 0,36 Н. раствора соляной кислоты в течение 20 мин. Нерастворимый материал удаляют центрифугированием и промывают дважды по 5 мл 0,36 Н. раствора соляной кислоты. Соединенные верхние слои жидкости затем перемешивают с 320 мг активированного угля марки «Дарго С-60 и фильтруют через диатомовую землю с образованием почти бесцветного раствора.

Фильтрат экстрагируют дважды по 10 мл н-бутанола. После удаления бутанола под вакуумом получают аморфное твердое вещество. Это вещество превращают в тонкоизмельченный порошок растворением в небольшом количестве метанола, добавлением этилацетата до осаждения антибиотика с последующим удалением смеси растворителей под вакуумом. Порошок затем высушивают при 50°С и 0,02 мм рт. ст. в течение нескольких, например пяти, часов, а затем подвергают воздействию атмосферной влаги в течение ночи.

12

Пример И. Раствор 500 мг хлоргидрата: антибиотика ЕМ-49, полученный по методике примера 10, растворяют в 5 мл воды и хроматографируют на колонне размером

2,5X60 см, заполненной целлюлозой марки «Ватман СМ-52 (натриевая форма карбоксиметилцеллюлозы), выдерживаемой при 50°С, со скоростью потока 75 мл в час. Колонну элюируют 0,15 Н. раствором хлористого натрия, собирая 600 небольших фракций (примерно по 24 мл). Размер вытекающих фракций определяют по поверхностному натяжению, так как антибиотики снижают поверхностное натяжение так, чтобы стекающие с

постоянной скоростью фракций, содержащие антибиотики, имели уменьщенный объем. Зависимость объема фракции от всего объема алюированного антибиотика - обратная. Элюирование продолжают (примерно 161) до

элюирования трех веществ, названных ЕМ-49 альфа, ЕМ-49 бета и ЕМ-49 гамма. Колонну затем элюируют 0,2 н. раствором хлористого натрия для элюирования четвертой фракции, показанной на графике поверхностного натяжения, обозначаемой ЕМ-49 дельта.

Фракции, содержащие, соответственно, ЕМ-49 альфа, бета, гамма и дельта соединяют. Каждую фракцию экстрагируют 50%

(от ее объема) н-бутанола. Бутанольные экстракты промывают дважды равными объемами 0,36 н. раствора соляной кислоты, а затем упаривают досуха.

Каждый из перечисленных остатков растворяют в метаноле, осаждают этилацетатом, промывают этилацетатом и эфиром, высушивают при 75°С и 0,02 мм рт. ст. в течение 1,5 час, а затем подвергают воздействию атмосферной влаги для равновесия, оставляя на

ночь.

Анализ каждой фракции, полученной в виде хлоргидратов, показал следующие результаты (табл. 1).

Образцы фракций ЕМ-49 альфа, бета, гамма и дельта подвергают гидролизу в 6 н. растворе соляной кислоты при 110°С в течение ночи. Каждый гидролизат экстрагируют эфиром с целью удаления жирных кислот. Остаток применяют для анализа аминокислот. Аминокислотный анализ фракций показал, что фракции ЕМ-49 альфа и бета отличаются от фракций ЕМ-49 гамма и дельта по остаткам амипокислот следующим образом

(табл. 2).

ИК-спектры каждой из перечисленных фракций изображены соответственно на фиг. 5-8. Каждая такая фракция, так же как

и хлоргидрат антибиотика ЕМ-49, растворима в воде, метаноле, этаноле, диметилсульфоксиде и уксусной кислоте и не растворима в ацетоне, этилацетате, эфире и ацетонитриле. Каждая из этих фракций образует соли такого же типа,, как антибиотик ЕМ-49.

Таблица 1

Мол. вес и брутто-формулы приведены в расчете на безводные вещества. Таблица 2 Остаток на молекулу 2,4-Диаминомасляная кислота. Эфирные экстракты гидролизатов содержат жирные кислоты, отщепляемые из антибиотика. Их обрабатывают диазометаном с образованием сложных метиловых эфиров. Полученные метиловые эфиры оценивают методом газовой хроматографии. Жирные кислоты, выделенные из фракции ЕМ-49 альфа, отличаются от жирных кислот, выделенных из фракции ЕМ-49 бета, а жирные кислоты, выделенные из фракции ЕМ-49 гамма, отличаются аналогичным образом от фракции ЕМ-49 дельта. Две фракции ЕМ-49 альфа и бета можно отличать от фракций гамма и дельта по небольшому иику при 696 в ИК-спектре последней пары фракций, что характеризует присутствие остатка фенилаланина. Аналогично УФ-спектр для нары фракций гамма и дельта имеет характерный пик поглощения, свойственный остатку фенилаланина, между 245 и 270 ммк и такой характерный рисунок спектра отсутствует в спектре поглощения ультрафиолетовых лучей для пары фракций альфа и бета. Пример 12. 70 г порощка, не растворимого в ацетоне, полученного по методике, описанной в примере 5, экстрагируют дважды по 200 мл воды (рН 7,5) и бутанолом. Водные слои, не обладающие антибиотическими свойствами, отбрасывают. Бутанольные слои соединяют и экстрагируют 4 раза по 200 мл воды, насыщенной бутанолом при рН 1,0. Соединенные водные экстракты содержат наибольщее количество активного материала, состоящего из антибиотика ЕМ-49 и малоподвижной фракции (МПФ). Водный экстракт концентрируют под вакуумом до состояния сиропа и осаждают ацетоном. Вес полученного порошка, не растворимого в ацетоне, составляет примерно 15 г. Антибиотик ЕМ-49 и малоподвижную фракцию сначала грубо разделяют растворением 15 г твердого вещества в 30 мл метанола и пропусканием этого раствора через колонну, заполненную диэтиламиноэтилцеллюлозой (4,5X60 см) в метаноле. После окончания выхода из колонны окрашенного раствора элюируют МПФ 2%-ным раствором уксусной кислоты в метаноле. Собирают фракции объемом примерно 50 мл до прекращения вытекания из колонны активных веществ, что определяют испытанием с применением дисков в отношении Е. соН (SC2927) на агаровых пластинах. Фракции затем подвергают анализу посредством тонкопленочной хроматографии на листах из кремневой кислоты по Гельману с применением системы растворителей: бутаНОЛ : изомасляная кислота : пиридин : вода (40 : 9 : 4 : 10), а также биологически на агаровых пластинах, засеянных Е. соИ. Фракции, содержащие МПФ (Rf 0,15), соединяют и концентрируют досуха с получением примерно 5 г. Это твердое вещество затем подвергают распределительной хроматографии на смеси кремневой кислоты с целлюлозой (2 : 1 по весу, размер колонны 3X60 см) с применением того растворителя, что при тонкослойной хроматографии. Па этой колонне происходит разделение фракций ЕМ-49 и МПФ, их подвергают анализу путем тонкослойной хроматографии. Снова соединяют нужные фракции и. упаривают их досуха, получая приглерно 300 .vtr остатка. Для дальнейшей очистки соединения операцию распределительной хроматографии повторяют. Образец растворяют в смеси ацетона и метанола (1:1) и пропускают через колонну с «Сефадексом Ln 20, которую пропитывают и заполняют тем же растворителем. При проявлении тем же растворителем можно заметить отдельные полосы. МПФ не вытекает с первыми порциями растворителя. Фракции снова

15

подвергают анализу путем тонкослойной хроматографии и фракции, расположение пятен у которых соответствует МПФ, соединяют и упаривают досуха. Обпдий выход составляет примерно 150 мл. Продукт имеет желтый цвет, не плавится до 310°С, от 270°С изменяет цвет до коричневого.

Кристаллическую соль Рейнеке этого образца получают растворением 100 мг готового продукта в 5 мл воды, после чего доводят соляную кислоту до рН 2-3. Затем добавляют по каплям насыщенный водный раствор рейнеката аммония до прекращения выделения осадка. Жидкость центрифугируют, и осадок промывают однократно 5 мл воды. Затем осадок высушивают и перекристаллизовывают из 50 мг смеси ацетона с гексаном. Кристаллический рейнекат МПФ представляет собой порошок красного цвета, не растворимый в воде, но хорошо растворимый в ацетоне и метаноле. Он не дает четкой температуры плавления, но разлагается при 198-200°С. Испытания на цветные реакции показали следующие результаты: нингидрин (-), антрон (-), гидролизат на нингпдрин (-f).

Антибиотик ЕМ-49 МПФ показывает конечную абсорбцию в УФ-спектре (см. фиг. 9).

Найдено, %: С 50,46; Н 6,47; N 11,69, нейтральный эквивалент 584.

Для молекулярного веса 12000 элементарный анализ соответствует формуле

C5oH76NioO24Гидролизат получают гидролизом 2,012 мг антибиотика в 6 мн. растворе соляной кислоты при 110°С в течение 17 час и подвергают анализу на содержание аминокислот, которые присутствуют в следующих количествах, моль:

2,4-Диаминомасляная кислота 1,74 NH4OH1,01

Треонинследы

Серии0,84

Глутаминовая кислотаследы

Алании0,51

Валин0,82

Лейцин0,45

Фенилаланнн0,47

Тирозинследы

Кристаллический рейнекат антибиотика ЕМ-49 МПФ имеет температуру плавления 198-200°С (с разложением), а УФ-спектр имеет максимум поглощения при 240 ммк (Е1« 450) и 315 ммк ( 350).

16

Полученный рейнекат не растворим в воде и растворим в ацетоне и метаноле.

Пример 13. Двухкратные испытания на разбавление в пробирках для некоторых микроорганизмов дали следующие результаты. Антибиотик ЕМ-49 применяют в данных опытах в виде хлоргидрата, и его чистота соответствует светло-бурому порошку, описанному в примере 6 (табл. 3). ТаблицаЗ

Staphylococcus aureus ГДА 209Р Streptococcus pyogenes С 203 Esherlchia coil АТСС 10536 Esherlchla соН SC 8294 Pseudomonas aeruginosa SC 8329 Candida alblcans SC 5314 Candida krusel SC 2616 Saccharomyces cerevlslae SC 1600 Asperglllus niger SC 2828 Fusarlum bulblgenum SC 5273 Trichophyton mentagrophytes SC 26 Trichomonas vaginaHs SC 8660

Организмы из коллекции культур Сквибба.

Пример 14. Для испытаний in vivo мышам вводят внутрибрюшинно 100 доз LDso Streptococcus pyogenes С203. Испытания показали, что выжило только 50% мыщей при введении всего 120 мг/кг антибиотика ЕМ-49 в виде хлоргидрата подкожно в два приема:

через 1 час и через 5 час после заражения. В контрольной группе мышей, не получавших антибиотика, выживших мышей нет.

Пример 15. Аналогично, при введении мышам внутрибрюшинно 500 до LDso штамма микроорганизма Esherichia coli SC 8294, суспендированного в 5% муцина, выделенного из свиного желудка, 50% мышей выжило при подкожном введении антибиотика ЕМ-49 в виде хлоргидрата в количестве 50 мг/кг

через 1 час после заражения. Все мыши, не получившие антибиотика, погибли.

Пример 16. Испытания па двукратное разбавление в пробирках с указанными микроорганизмами дали следующие результаты (табл. 4).

Предмет изобретения

Способ получения антибиотика путем культивирования культуры Bacillus circulans в аэробных условиях, в водной питательной среде, содержащей источник углерода, азота и минеральные соли, с последующим выделе4W J500

нием целевого продукта из фильтрата культуральной жидкости и хроматографическим разделением его на активные компоненты, о тличающийся тем, что в качестве продуцента целевого продукта используют штамм Bacillus circulans АТСС 21656. 2000 1800 то Viiz.l 1UOO то woo SOO 62Ь 1600 шо то

9 10 12 15 20 3D +050