Способ получения антибиотика казугамицина Советский патент 1974 года по МПК C12D9/10 C12D9/10 

1

Изобретение относится к способам получения физиологически активных веществ с номощью микробиологического синтеза, точнее к способу получения антибиотика казугамицина.

Казугамицин подавляет рост и предупреждает развитие Piricularia orizae, не оказывая вредного влияния на растения. Он образует кристаллические соли с бромистоводородной, серной, соляной и другими кислотами.

Хлоргидрат казугамицина представляет собой бесцветное кристаллическое вещество, растворимое в воде, почти не растворимое в метаноле, этаноле, бутаноле, ацетоне, эфире, хлороформе и бензоле, в УФ-спектре которого отсутствуют полосы поглощения при 220- 400 ммк. Это вещество дает положительную реакцию на нингидрим в пиридине и отрицательную реакцию Сакагучи, Молища, ЭлтсонМоргана, Фелинга, Толленса и Селиванова.

Для хлоргидрата а + 120° (,6% вода); т. пл. 202-204°С (с разл.), рКа 7,1; мол. вес 453 по данным титрования и 449 по данным осмометрии.

Ci5H270ioN3 - НС1 . НгО.

Вычислено, %: С 38,44; Н 6,52; N 9,06; О 37,94; С1 7,64.

Найдено, %: С 38,58; 38,34; Н 6,94 и 6,62; N 9,66 и 9,04; О 37,05 и 37,54; С 8,16 и 8,39.

Cl5H270ioN3-HBr.H2O.

Вычислено, %: С 35,44; Н 5,95; N 8,27; О 34,62; Вг 15,72.

Найдено, %: С 35,27; Н 6,00; N 8,48; О 33,31; Вг 16,94.

ИК-спектор (таблетки КВг) хлоргидрата казугамицина, 3520, 3350, 3200, 3070, 2950, 2050, 1695, 1670, 1624, 1522, 1462, 1379, 1323, 1286, 1224, 1180, 1135, 1120, 1090, 1080, 1060, 1042, 1025, 975, 945, 908, 890, 870, 846,

825, 783, 709.

ЯМР-спектор (D20, натриевая соль 3-(триметилсилил)-пропансульфоновой кислоты в качестве стандарта, прибор Вариан 60), м. д.: 1,22; 1,32, 2,25; 2,33; 2,42; 2,50; 3,55; 3,79; 4,05;

4,38; 4,50; 4,70,5; 32,5; 5,35. Реакция с антроном после обработки азотистой кислотой дает красновато-бурую окраску. При высоком вольтаже электрофореза в системе муравьиная кислота - уксусная кислота - вода (25 : 75 :

; 900), рН 1,8, 3000 в/40 см, 15-20 ма/10 см и 10°С в течение 15 мин казугамицин перемещается на 3,7 см к аноду. Rf на фильтровальной бумаге Тойо № 159 в системе бутанол-уксусная кислота - вода (2:1:1) равно 0,28, в

системе бутанол-этанол-вода-аммиак (4 :

: 1 : 4,9 : 0,1) равно 0,07, а в системе бутанол--

уксусная кислота - вода (6,3 : 1 : 2,7) равно

0,06.

Кислотный гидролиз .казугамицина дает

()-инозит, метанолиз дает метилированный остаток, а баритовый гидролиз приводит к образованию Ci4H26OioN-21-120, который, гид ролизуясь дальше, образует Ci2H26O7N2 и щавелевую кислоту. При нагревании водного раствора казугамицина при 60°С в течение 1 час при рН 2,0; 5,0; 7,0 и 9,0 сохраняется 82,5; 99,0; 9,0 и 100% активности соответственно. После хранения в течение 6 час нри комнатной температуре в 0,1 п. соляной кислоте никаких явлений разложения не наблюдается; после хранения в 0,1 н. едком натре в течение 6 час сохраняется 85% активности. Казугамацип достаточно стоек при перегонке в вакууме, распылительной сушке или других способах, применяемых для концентрирования или сушки культуральных жидкостей или водных растворов, содержащих казугамицин. Известен способ получения казугамицина, включающий культивирование гриба из группы Streptomyces на питательной среде, содержащей источники углерода и азота, в аэробных условиях глубинным методом в течение времени, достаточного для перехода в культуральную среду основной части целевого продукта с последующим выделением его из культуральной жидкости. Предлагается в качестве гриба-иродуцентра использовать Streptomyces kasugaensis, культура которого, выделенная из почвы и имеющая лабораторное обозначение № 338-М1, хранится в американской коллекции типовых культур в Вашингтоне под номером АТСС № 15714 и АТСС № 15715. Характеристика S. kasugaensis. Микроскопическая характеристика. Субстратный мицелий дает тонкие отростки и образует длинные воздушные гифы, кончики которых имеют вид петель или спиралей, с образованием цепочек. Мутовки на наблюдаются. Под электронным микроскопом поверхность спор гладкая, без шипов или волосков. В чашках с агаро-глицериновой средой Чапека (глицерин-нитратный агар) после инкубации при 27°С колонии от кремового до серо-оливкового или желтовато-коричневого цвета. Скудный белый воздушный мицелий. Бледно-оливковый или бледный желтоватокоричневый пигмент в среде. В чашках с глюкозо-аспарагиновым агаром Краинского после инкубации при 27°С колонии от кремового до светло-коричневатого цвета или с красновато-бурым оттенком. Воздушный мицелий от белого до светло-оливкового или серо-оливкового цвета. Темно-желтоватый или темно-желтовато-коричневый пигмент в среде. На агаровой пластинке с яблочнокислым кальцием после инкубации при 27°С колонии цвета слоновой кости. Воздушный мицелий от белого до песочного цвета. Растворимого пигмента нет. Яблочнокислый кальций вокруг колонии обычно растворяется и становится прозрачпым, но в случае слабого роста это явление не наблюдается. В чашке с крахмальным агаром после инкубации цри 27°С колонии цвета слоновой кости. Белый воздушный мицелий. Растворимого пигмента нет. Гидролитическое действие слабое или отсутствует. В пептоновом растворе, содержащем 0,2% нитрата натрия, после инкубации при 37°С бесцветные колонии на поверхности. Отсутствие воздушного мицелия. Растворимый пигмент отсутствует. Нитрат восстанавливает. Па скошенном агаре носле инкубации при 37°С колонии от кремового до бледно-желтовато-коричневого или красновато-бурого цвета. Незначительное образование воздушного мицелия. Растворимый пигмент отсутствует. На молочном обрате после инкубации при 37°С бесцветные колонии без воздушного мицелия. Коагуляция или нептонизация наблюдаются лишь изредка и в слабой степени. Растворимый пигмент отсутствует. На желатине после инкубации при 18-20°С бесцветные колонии, иногда приобретающие красновато-бурую окраску. Бледно-коричневатый растворимый пигмент. Иногда наблюдается разжижение желатины. Потребление источников углерода при выращивании в основной среде Придгем-Готлиба после инкубации нри 27°С: усваивает глюкозу, фруктозу, галактозу, маннозу, инозит, мальтозу и рафипозу, давая обильный рост. Плохо усваивает рамнозу, сорбит, салицин, дульцит, сахарозу и инулин. Незначительно усваивает арабинозу, лактозу, декстрин и крахмал. Образование антибиотика казугамицина. Штамм № М338-М относится к роду стрептомицетов, с длинным воздушным мицелием, кончики которого имеют вид петель или спиралей. Поверхность спор гладкая. Протеолитическая активность слабая. Цвет воздущного мицелия от белого до серо-оливкового, а цвет колоний от кремового до бледно-желтоватокоричневого или красновато-бурого. Нехромогенного типа. Образует казугамицин. Штамм № М 338-М1 близок к S. fHlvissinms и S. galbus. Однако S. galbHs имеет волосистую структуру (на поверхности спор), а . fHlvissimus вырабатывает золотисто-желтый растворимый пигмент и проявляет сильное протеолитическое действие. Выделенный из очвы штамм № М 338-М1 образует также другие антибиотики-ауреотрицин и тиолютин. Поэтому штамм N° М 338-М1 следует сравнить с S. thiolHtes, S. celluloflavus и S. суапоПаицз. S. образует завитки. S. celbloflavus бразует желтовато-зеленый пигмент и проявяет сильное протеолитическое действие . cyanoflavus не образует спиралей, дает зееновато-синий пигмент и проявляет сильное ротеолитическое действие. По этим признаам штамм М338-М1 отличается от указаных видов. Кроме того, штамм М 338-М1 отличается от этих видов своей чувствительностью к различным антибиотикам.

Мутанты штамма № М 338-С1 с более интенсивной желтоватой окраской были получены в результате односпорового рассева штамма М 338-М1, а мутанты с красноватым или красновато-нурпурным цветом были получены при выделении отдельных колоний после УФ-облучения. Мутанты, не образуюшие ауреотрицин и тиолютин, но образующие казугамицин, получены из штамма № 338-М1, который первоначально вырабатывал аурсотрицин и тиолютин.

S. kasugaensis вырабатывает казугамицин нри выращивании в соответствующих условиях. Культуральную жидкость, содержащую казугамицин, получают путем посева спор или мицелия микроорганизма в соответствующую среду и выращивания в аэробных условиях. Ферментацию обычно проводят при 25-35°С.

В качестве источника азота используют пептон, мясной экстракт, кукурузный экстракт, размолотый хлопковый , размолотый арахис, соевую муку, дрожжевой экстракт, N-Z-амин, казеин, нитрат натрия, нитрат аммония, сульфат аммония и другие азотсодержащие соединения, например пшеничную или рисовую муку.

В качестве источника углерода пригодны лактозы, глицерин, сахароза, крахмал, глюкоза, мальтоза, меласса и другие углеводы в чистом или неочищенном виде. Предпочтительны чистые или неочищенные мальтозы и , гидролизованный до мальтозы. Можно также добавить хлористый натрий, фосфат натрия или калия, карбонат кальция или сульфат магния, соли металлов.

Ферментацию продолжают до накопления достаточного количества казугамицина в культуральной жидкости. Например, споры или мицелий культуры S. kasugaensis на скошенном агаре высевают в среду, содержашлю 2% глюкозы, 1,5% соевой муки, 0,1% К2НРО4, 0,05% MgS04-7H2O и 0,3% хлористого натрия, доводят рН до 7,0, выдерживают в колбах на качалке в аэробных условиях при 27°С. Накопление казугамицина отмечают на третий - пятый дни. В этом случае одновременно продуцируются аурестрицин, тиолютин и полиеновые антибиотики. Казугамицин с трудом извлекается из культуральной жидкости, например бутанолом, бутилацетатом и этилацетатом, в то время как ауреотрицин или тиолютин и полиеновые антибиотики хорошо извлекаются особенно бутанолом.

Пример 1. Для определения антибиологической активиости казугамицина 100 г измельченной зеленой .листвы или рисовой соломы заливают 1 л воды, кипятят 30 мии, фильтруют через четыре слоя марли, доливают поду к фильтрату, доводя объем жидкости до 1 л. К полученному раствору добавляют сахарозу и агар (конечная концентрация 5,0 и 2,2% соответственно). Затем 20 мин стерилизуют в автоклаве при 120°С, смешивают со

стерилизованным буфером (рН 3,5), состоящим из 1/15 М двухзамещенного фосфорнокислого натрия и 1/15М соляной кислоты (или 0,1 М лимонной кислоты и 0,2 М фосфата натрия, взятых в отнощении 24,3 : 25,7, чтобы довести рН до 5,0) в отношении 1:1, 10 мл полученной смеси выливают в чашку Петри диаметром 10 см и дают застыть. 4 мл суспензии снор Р. oryzae в указанной среде выливают на

поверхность застывшей среды. Поверх засеянной агаровой среды ставят цилиндры и наполняют образцом или стандартным раствором, рН которого должен быть равен рН среды. Чашку Петри инкубируют 48 час при 27°С.

Измеряют диаметр зоны задержки роста вокруг каждого цилиндра. Хлоргидрат казугамицина в дозе 30 мгк/мл дает зону задержки роста диаметром 30 мм. Если в растворе образца содержатся ауреотрицин, тиолютин или

полиеновые антибиотики, то определение проводят после их извлечения бутанолом при рН 2,0.

Пример 2. Для приготовления культуры в колбы на 500 мл помещают 125 мл среды и

при 27-29°С на качалки (амплитуда 8 см, 200 качаний/мин).

При выращивании в ферментерах из нержавеющей стали емкостью 30 л в 15л среды подают 20 л/мин воздуха и перемен1ивают со

скоростью 600 об/мин.

При работе с ферментерами емкостью 400 л в них загружают 180-200 л среды и подают 200 л/мин воздуха при перемеишвании со скоростью 200 об/мии.

При посеве в колбах на качалках и ферментерах со скощенного агара со штаммом ЛЬ М 338-М1 высевают петли в среду (рН 7), содержащую 1,5% глюкозы. 1.5% соевой МУКИ, 0,1% КоНРО,, 0.05% .MgSO4-7H2O, 0,3%

NaCl и 0,5% СаСОз. встряхивают в колбах в течение трех дней при 27-29 С. Полученную культуральную жидкость используют для носева.

Пример 3. В колбах на качалках при исиользовании основной среды (рН 7), содержащей 1,5% соевой муки 0,1% К2НРО.,, 0,05% MgSO4-7H2O и 0.3% NaCl. и различные источники углерода, по,1учают данные, приведенные в табл. 1.

Пример 4. При основной среде, содержащей различные источники азота, 1,5% мальтозы, 0,3 NaCl 0,1% К9НРО4, 0,1% MgSOj7НоО, 0,0007% CuSO4-5H.O, 0,0001% FeSO.,. 7Н20 0.0008% МпСЬ 4Н2О и 0,0002% ZnS64-7H2O, рН 7,0, получены результаты, приведенные в табл. 2.

Казугамицин может быть выделен из водных растврров адсорбцией на активирова нгом

угле или катиопообменной смоле, содержащей в качестве активной групны сульфоновую кислоту. Элюирование производят кислым водным раствором или лучще водным раствором аммиака. При использовании сульфосмолы

элюированию способствует увеличение конТаблица 1

Таблица 2

центрации соляной или серной кислоты выше 0,5 н.45 Стойкость казугамицина в водном растворе аммиака при 37°С представлена в табл. 3. Таким образом, элюирование аммиака проводят при возможно более низких температуре и концентрации. Желательно также быстрее 50 доводить рН элюата до нейтрального, после чего упаривать его в вакууме. Казугамйцин посвоему строению относится к сахарам и поэтому может адсорбироваться анионообменной смолой, обработанной борной 55 кислотой, и может быть элюирован соляной кислотой. Анионообменные смолы в ОН-форме пригодны для нейтрализации кислых растворов казугамицина (рК казугамицина равен 6,6-7,1) и, следовательно, казугамицин яв- 60 ляется слабым основанием. Адсорбция казугамицина катионообменной смолой задерживается или снижается при наличии примесей, имеющих свойства сильного основания. Поэтому катион ообмеины.е:С.моль1 прлезць также .155 для удаления в случае необходимости примесей, являющихся сильными основаниями. Материал, содержащий казугамицин и примеси с сильными основными свойствами, пропускают через колонну, содержащую соответствующее количество IRC-50, Na или Н-типа, для удаления сильных оснований, а затем казугамидин адсорбируют смолой IRC-120. с которой его элюируют. Таблица 3 Активность, ;, через Для удаления массы мицелия из культуральной жидкости могут быть использованы фугование, фильтрация и другие обычные.CUQсобы; Отделение мицелия происходит легче при подкислении культуральной жидкости и добавлении активироваппого угля. Культуральная жидкость поступает па ионообменную колонну после удаления твердых частиц, включая мицелий, или сначала поступает на фильтрацию через решетчатый фильтр, достаточно мелкий, чтобы поддерживать частицы смолы, после чего фильтрат, содержащий мелкий мицелий, может поступать па ионообменную колонку. рН культуральпой жидкости доводят до 2,0 и добавляют 0,5% активированного угля от конечной концентрации. После достаточного перемешивания и фильтрации рН фильтрата доводят до 5,5-6,5 и направляют в колонну, загруженную смолой IRC-50 в Н-форме, неспособной адсорбировать казугамицип. рН прошедшего раствора доводят до 4,0 и подают на колонку, содержашую IR-120 в Н-форме или лучше аммиачного типа, чем Na-типа (для адсорбирования казугамиципа). Затем элюируют водным раствором аммиака и элюат нейтрализуют. В этом случае желательно проводить элюирование при температуре ниже 15°С и нейтрализовать элюат в крайнем случае не позже 5 час после элюирования. Элюат выпаривают досуха или сушат вымораживанием до получения порошка-сырца казугамицина. По другому способу в культуральпую жидкость добавляют активированный уголь. Адсорбироваппый казугамицин элюируют водпометанольным раствором, подкисленпым соляной кислотой, и элюат концентрируют и сушат. Полученный таким образом порошок-сырец может подвергаться дальнейшей очистке смолой IR-120 описанным выше способом. По третьему способу порошок-сырец растворяют в воде и пропускают через колонку с активированным углем. После промывки элюируют соляной кислотой, например 0,05 н, а активные фракции нейтрализуют апионообменной смолой. После концентрации в вакууме добавляют 10-25 объемов этанола, выдерживают при низкой температуре и получают кристаллы хлоргидрата казугамицина. Описанные способы являются предпочтительными при экстрагировании и очистке казугамицина. Так же как и при получении других антибиотиков, кристаллы могут быть получепы и без хроматографии на активированном угле, если концентрация казугамицина в культуральпой жидкости достаточно высока. Например, вакуум-выпарка активного элюата, полученного с IR-120, дает кристаллы хлоргидрата казугамицина при содержании в культуральной жидкости казугамицина в концептрации свыше 500 мкг/мл. При использовании серной кислоты (вместо соляной) можно получить сульфат казугамицина. Ввиду слабых основных свойств казугамппина он может быть получен осаждением из водных растворов добавлением кислых и водонеастворимых веществ, таких как пентахлорфеол, лазфилсульфоновая кислота, тергитол. Казугамицин проявляет сильное защитное ействие против пирикуляриоза риса без фитооксичности. Хотя он и пе подавляет рост Р. oryzae в концентрации 100 мкг/мл в среде Sabaurand, он подавляет рост этого гриба при 0,1 -1,0 мкг/.мл в подкисленном рисовом соке. Он эффективен также в опытах в тепличных условиях. Листья риса заражают суспензией Р. oryzae в стерилизованной воде, выдерживают 20- 24 час во влажной теплице н затем - в обычной теплице семь дней, п подсчитывают число пятен на 10 листах из трех вегетационных сосудов. В одном опыте опрыскивание казугамицином в концентрации 5 мкг/мл уменьшило количество пятен на 10 листах до восьми при 20 мкг/мл - до 0,3, при 40 мкг/мл - до пуля, в то время как контрольные листья без нанесения казугамицпна дали 176 или даже больше пятен. Зашитный эффект казугамицина превышает защитное действие бластицидина S. Казугамицин в концентрацнн 100 мкг/мл п: вызывает фитотоксических явлений у рисовых растений. Для зашиты риса от пирпкуляриоза нет необходимости в тшательной очистке казугамнцина. Можно использовать саму ку.пьтуральную жидкость продуцента казугамицина или высушить ее для получения порошка. Несмотря на то, что бластицндин S известен как эффективный антибиотик против пирикулярноза риса, его можпо легко отличить от казугампципа по физпкo-xп ичecкнм свойствам, антимикробному действию н токсичностт), Бластнпидин S, оказывает сильное токсическое действие на животных и людей и фитотоксическое действие в концентрации, превышающей 20 мгк/мл. Хотя казугамицин относится к аминосахарам, по физико-химическим свойствам, он отлнчается от трегалозамина своей фор1мулой, антимикробным действием, хро: гатографпей на бумаге, и также легко отличается от гигромицина В и В оптическим вращением, антимикробным действием и прочими свойствами, Казугамицин обнаруживает специальный антимикробный спектр в специальных условиях и среди известных антибиотиков нет по.аобного соединения, 5, Среду, содержащую 1,5% глюкозы. 1.2% соевой МУКИ, 0,1% К-НРО, 0,05% MgS04-7H2p, 0,3% NaCl, 0,5% СаСОз и 40мл силиконовой смолы, загружают в 400-л ферментер из нержавеющей стали. После стерилизации рН доводят до 6,6, Для гащения пены сбоку ферментера устанав.чпвают резервуар на 900 мл соевого мас,гга, и после 30 час инкубирования при,тпвают дополнительно 500 мл соевого масла. Условия сЬерментацин следующие: перемеп1пвание 200 об/мин, ВОЗДУХ - 180 л/мин, температура инкубации 27°С, рН после 24 час инкубирования и через каждые 6 час вплоть до 90 час от начала инкубации соответствеппо: 6,2; 5,4; 5,1; 5,2; 5,3; 3,8; 5,8;

11 5,9; 6,0; 5,7; 6,6 и 6,6. Через 92 час ферментации берут культуральную жидкость. Казугамицин, находящийся в культуральной жидкости, дает зону иодавления роста диаметром 30 мм. Раствор, разбавленный в 128 раз, эффективен при борьбе с пирикуляриозом риса в вегетационных сосудах. Эту культ ральную жидкость подают на центрифугу Шарплесс для отделения мицелия, при этом получают 310 л фильтрата. рН фильтрата доводят до 7.0 и добавляют 12,5 кг активированного угля. После перемешивания фильтруют от угля через фильтрующую ткань и филг: тровальную бумагу, Фильтрат обладает лишь 5-10% активности культурального сЬильтрата. К «нирогу. по.пученному пос.т1е фильтрации, добавляют 37,5 л растворителя, состоящего из бутанола и воды fl : 2) и элюируют при 45°С, доводя рН до 2,0 соляной кислотой. Элюирование новторяют три раза ц элюаты собирают вместе. Элюату (112,5 л) дают отстояться, а водный слой в 90 л концентрируют (упаривают) в вакууме до объема 3,58 л. Кпнцентрированный раствор сушат вымораживанием и получают 1,23 г казугамицина в виде бурого порощка (степень чистоты 1,8%). Пример 6. Среду объемом в 180 л того же состава, что и в примере 5, загружают в ферментер на 4000 мл и добавляют 18 мл силиконовой смолы. После доведения рН до 7,0 1 н. едким натром проводят стерилизацию при 120°С в течение 20 мин. Среду асептически засевают 1500 мл трехдневной культуральной жидкости (полученной в колбах на качалке) штамма № М 338-М. Сбоку ферментера устанавливают резервуар с 900 мл соевого масла для пеногашения. Кроме того, через 21 час после начала ферментации добавляют 200 мл соевого масла и 300 мл через 22 час. Перемешивание - 200 об/мин, аэрация - 150 л/мин в течение всего процесса ферментации, температурный режим в интервале 27-28°С. рН, общее содержание Сахаров и количество казугамицина определяют через 12, 24 час и затем через каждые 6 час до истечения 92 час с начала ферментации. При этой ферментации одновременно образуется ауреотрицин (или тиолютин). Результаты приведены в табл. 4. Полученную культуральную жидкость, содержащую 518 мкг/мл или 82,944 г казугамицина, подкисляют 1 н. соляной кислотой до рП 2,0, и загружают активированный уголь в количестве 0,5%. Полученную смесь нодают на центрифугу Шарплесс с числом оборотов 15000 об/мин и получают 160 л фильтрата (460 мкг) мл, всего 73,728 г казугамицина. Фильтрат подщелачивают 1 н. едким натром, доводя рН до 7,0, и добавляют 3,2 кг активированного угля (2,0%) для адсорбирования казугамицина. Затем опять фугуют на той же центрифуге, собирают угольный «пирог. Жидкая часть содержит казугамицин в концентрации 17,12 .л и сохраняет 29,1% активности исходной культуральной жидкости. Угольный «пирог обрабатывают 22,5 л

12 Таблица 4 90%-ного метанола и 1 н. соляной кислотой, доводя рН до 2,0. Элюирование проводят при 40°С. Затем проводят второе элюирование 80%-ным метанолом и получают 45,21 л элюата. Элюат содержит казугамицин в концентрации 851,8 мкг/мл (всего 38,501 г); выход or первоначальной культуральной жидкости par вен 46,41%. рН элюата доводят до 4,0-5,0, метанол отгоняют в вакууме. Полученный таким образом водный раствор сущат вымораживанием и получают бледно-желтоватый порощок с активностью 54 мкг/мг (по расчету 36,504 г казугамицина). Выход порошка составляет 44% в пересчете на первоначальный раствор, а чистота равна 5,4%. Пример 7. 150 г порошка-сырца (1,8% чистоты), полученного как в примере 5, растворяют в 2 л дистиллированной воды и подают на колонку высотой 100 см, диаметром 5 см, заполненную углем для хроматографирования. Скорость потока 3- мл/мин при комнатной температуре. Протекающая жидкость не обнаруживает присутствие казугамицина. Колонку с углем промывают 4 л дистиллированной воды и 0,05 н. соляной кислоты. Первая фракция 1600 мл при рН 5,6 не содержит казугамицина. Следующая фракция в 3000 мл имеет рН 1,0, и цоследующая фракция 200 мл также имеет рН 1,0. Обе они содержат казугамицин. Эти активные фракции нейтрализуют ионообменной смолой (Dowex-3) и концентрируют в вакууме до объема 10 мл. К полученной массе добавляют 200 мл этанола и оставляют на ночь при 4°С, выпадает желтовато-белый осадок. После фильтрации и сушки осадка получают 10,84 г белого порошка. Выход составляет 97,8%. Пример 8. 1,15 г порошка, полученного как в примере 7, (с 36% чистоты) растворяют

13

в 150 мл дистиллированной воды и доводят рН до 7,0. Раствор подают на колонку с углем, длиной 29 см, диаметром 3 см. Процесс ведут при комнатной температуре, скорость потока 1 мл/мин. Колонку промывают 350 мл дистиллированной воды. Затем пропускают 0,02 н. соляную кислоту и элюат фракционируют по 10 мл. Начальная фракция (520 мл) с рН 5,6 не содержит казугамицина. Ближайшие две фракции 20 мл (рн 4,0) не содержат казугамицина. Следующая фракция 10 мл (рН 2,0) содержит казугамицин, но при хроматографировании на бумаге обнаруживает присутствие некоторых веществ, дающих положительную реакцию на нингидрин. Следующие 130 мл, рН ниже 1,0, содержат казугамицин, но содержат также и другие вещества, дающие положительную реакцию на нингидрин. Следующие 430 мл, рн ниже 1,0, содержат казугамицин без примеси веществ, дающих положительную реакцию на нингидрин. Эту фракцию нейтрализуют смолой Dowex-3 и концентрируют в вакууме до 5 мл. К концентрату приливают 100 мл этанола и получают белый порощок весом 301 мг, 92% чистоты. Выход 66,8%. Порощок перекристаллизовывают из воды и получают 120 мг хлоргидрата казугамицина в виде кристаллов.

Пример 9. Среду, содержащую 1,5% мальтозы, 1,5% соевой муки, 0,1% К2НР04, 0,05% MgS04-7H2O, 0,3% NaCl (рН 7,0), засевают щтаммом № М 338-М1 и взбалтывают в колбах на качалке. 3450 мл культуральной жидкости, содержащей казугамицин, подкисляют 1 н. соляной кислотой, доведя рН до 2,0, добавляют 1% Hyflesupercelle и 0,5% активированного угля и фильтруют. При этом казугамицин практически не адсорбируется. рН фильтрата доводят до 7,4 и добавляют 2% активированного угля для адсорбирования казугамицина. Собирают угольный «пирог, адсорбировавший казугамицин. В этом случае фильтрат содержат еще примерно 10-23,5% казугамицина. Затем угольный «пирог обрабатывают 690 мл 80%-ного метанола, подкисляют 2 н. соляной кислотой, доведя рН до 2,0, и проводят элюирование при 45°С. Добавляют 350 мл 80%-ного метанола и повторяют элюирование. Собирают вместе оба элюата. Содержание казугамицина в элюате 62%. Подщелачивают метанольный элюат 1 н. едким натром, доведя рН до 4,0, и упаривают в вакууме до сиропообразного состояния. К концентрату приливают этанол до прекращения выпадания осадка. Этот осадок содержит казугамицин, а верхний слой жидкости содержит лищь 5-- 10% казугамицина. Собирают осадок и получают желтовато-белый порошок казугамицина 5,3% чистоты. Выход равен 45% в расчете на исходную культуральную жидкость.

Пример 10. 5г порошка, полученного как в примере 5 (1,8% чистоты), растворяют в 500 мл воды, доводят рН до 4,0. Раствор подают на колонку, заполненную 100 см смолы IR-120 в Н-форме, скорость потока 1 мл/мин.

14

После промывки колонки 1 л дистиллированной воды пропускают 0,5 н. раствора аммиака со скоростью 1 мл/мин. 100 мл раствора нейтрализуют 1 н. соляной кислотой, сушат вымораживанием и получают 1,6 г желтоватого порошка 9%-ной чистоты. Выход 88.9%.

Пример 11. Мутант, полученный из штамма М 338-MI путем односпорового рассева, выращивают в колбах на качалке в среде с таКИМ же составом, как в примере 5. в течение 72 час. 1 л культуральной жидкости засевают 100 мл среды, содержащей 1,5% соевой муки. 1,5% мальтозы, 0.3% -NaCl 0.1% MgSOr7H,0, 0,0007% CuSO4-5H2O, 0,0008% MnCl2-4H20,

0,0001% FeS04-7H20, 0,0002% ZnSO4-7H2O,

pH 7,4, в 200-Л ферментере, аэрация 100 л/мин

воздуха, перемешивание - 200 об/мин, при

28°С.

Через 48 час aioil культурой засевают

1400 л такой же среды в 2000-литровом ферментере и продолжают ферментацию. Через 48 час рН 6,9, а концентрация казугамицина 160 мкг/мл; через 90 час рН 7,2, а концентрация казуга мицина 530 мкг/мл. Культуральная

жидкость содержит 8,4 мкг/мл ауреотрицина. Ферментацию останавливают, а культуральную жидкость фильтруют через диатомитовую землю. Получают 1570 л фильтрата, включая промывные воды. Берут 100 л смолы IR-I20

в Н - форме и раствор аммиака в таком количестве, чтобы перевести 1/4 смолы в смолу аммиачного типа, затем промывают водой. Культуральную жидкость пропускают через колонку, заполненную вышеописанной смолой.

Первая фракция объемом 610 л не содержит казугамицина; следующая (950 л) содержит 65,2 г казугамицина. Эту фракцию пропускают через другую колонку со смолой. Проводят элюирование первой смолы, используя 0,5 М

раствор аммиака. Первый элюат (53 л) содержит 28,5 г казугамицина, второй элюат (200 л) - 738 г казугамицина, третий элюат (200 л)-44,2 г казагумицина. Элюат нейтрализуют соляной кислотой, доведя рН до

6,6. Второй элюат концентрируют в вакууме до объема 6,32 л и добавляют 60 мл этанола. Получают 850 г неочищенных кристаллов хлоргидрата казугамицина, 90%-ной числоты.

50

Предмет изобретения

1. Способ получения антибиотика казугамицина, включаюший культивирование гриба из группы Streptomyces на питательной среде, содержащей источники углерода и азота, в аэробных условиях глубинным методом в течение времени, достаточного для перехода в культуральную среду основной части целевого продукта, с последующим выделением его из культуральной жидкости, отличающийся тем, что в качестве гриба-продуцента берут Streptomyces kasugaensis АТСС № 15714 и АТСС № 15715. 15 2.Способ по п. 1, отличающийся тем, что питательпая среда содержит мальтозу. 3.Способ по п. 1, отличающийся тем, что казугамицин выделяют путем адсорбпии на угле или катионообмеипой смоле с после-5 дующим элюировапием. 16 4. Способ по п. 3, отличающийся тем, что катионообменпая смола содержит в качестве активпой группы сульфоновую кислоту, 5. Способ по п. 3, отличающийся .тем, что элюирование проводят раствором аммиака.