СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВЕЩЕСТВА, ОБЛАДАЮЩЕГО Советский патент 1973 года по МПК C12P1/04 A61K35/74 

1

Изобретение относится к области медицины, а именно к способам получения противоопухолевых препаратов.

Известен способ получения вещества, обладающего противоопухолевой активностью, например анти|биоти1ка аураптина, заключающийся в том, что культуру продуцента, выращенную на средах, содержащих питательные чкстраКты, экстрагируют органическим растворителем с дальнейшим выделением из экстракта делевого продукта.

В качестве продуцента противоопухолевого препарата предлагают использовать один из штаммов Культуры рода Lactobacillus, а именно Lactobacillus bulgaricus var. tumoronuroticans LB -51 № 93 или № 100, Lactobacillus helveticus var. tumoronecroticans № 31 или Lactobacillus acidophilius var. tumoronecroticans № 43, который выращивают в анаэробных условиях на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли в течение час при температуре 28-50°С, цельные или разрушенные клетки экстрагируют водой или фенолом, а целевой продукт выделяют ИЗ экстрактов либо осаждением минеральной или органической кислотой при рН 1,5-4,0, либо высаливанием, либо осаждением посредством органических растворителей, смешивающихся с водой.

Пример 1. Культурой Lactobacillus bulgaricus var. tumoronecroticans LB - 51 засевают 200 мл питательной среды, содержащей (%) соевого Экстракта-3, пептона - 5, мясного экстракта - 0,5, дрожжевого экстракта-0,5, сахарозы -0,5 и сульфата магния-0,1. Культивирование производится при температуре 37°С в течение 24 час, рН культуральной жидкости доводят 1ДО 6,5 и затем центрифугируют при

5000 об/мин в течение 30 мин.

Мышам с хорошо развитой саркомой 180, имплантированной подкожным путем, вводят внутривенно 0,5 мл надосадочной жидкости. Ни у одной ИЗ 20 подопытных мышей не образовалось некроза опухоли. Осадок бактериальных клеток измельчают IB ступе с кварцевым песком и экстрагируют посредством 100 мл дистиллированной воды. Смесь центрифугируют при 5000 д и надосадочную жидкость дозой 0,5 мл вводят внутривенно мышам

с саркомой 180. Через 24 час некроз опухоли

обнарул или у 17 Из 20 мышей, а через 10 дней

8 животных были излечены.

Пример 2. 3000 мл надосадочной жидкоети, полученной после гомогенизации разбавленных водой бактериальных клеток, приливают к 6000 мл 96%-ного ipacTBOpa этанола. Смесь выдерживают в течение 2 час при 4°С, затем центрифугируют.

Надосадоч 1ую лсидкость отделяют и осадок ра€Т|ВО|ряют в 600 мл воды, затем центрифхтируют для удаления нерастворимых остатков.

200 мл раствора подкисляют соляной кислотой, доводят рН до 2. Осадок отделяют центрифугированием, промывают эталолом и высушивают. Получают 9,4 г сухого вещества.

П р и.м е р 3. 200 мл чистого раствора, полученного после обработки бактериальных клеток способом, онисанным в нримере 2, смешивают с сульфатом аммония до 0,4 насыщения и ставят па 2 час в холоднльинк прп 4°С. Смесь цептрнфугируют. Надосадочную жидкость удаляют, осадок растворяют в воде и доводят рН до 7. Раствор диализируют через целлофан в проточной воде в течение 18 чис. Диализованную лсидкость центрифугируют, чтобы отделить небольщой нерастворивщийся остаток, затем лиофилизируют. Получают 7,4 г сухого вещества.

Пример 4. К 1000 мл надосадочпой жидкости, полученной иосле гомогенизации разбавленных водой бактериальных клеток, приливают 10 мл 20%-ного раствора хлористого кальция. Осадок центрифугируют и растворяют в 100 мл дистиллированной воды. К этой суспензии добавляют 3 г амберлита. После сильного взбалтывания смесь центрифугируют и Надосадочную жидкость лиофилизируют. Получают 1,8 г сухого вещества.

Пример 5. 500 мл надосадочной жидкости, полученной после гомогенизации разбавленных водой бактериальных клеток, смещивают с 500 мл 90%-ного фенола. Смесь сильно взбалтывают в течение 1 час при 4°С и центрифугируют при 5000 об/мин в течение 30 мин. Водную и фенольную фазы отделяют. Водную фазуПОДКИСЛЯЮТ соляной кислотой, доводя рИ до 2. Осадок отделяют центрифугированием, затем промывают этанолом и ацетоном и высзЩивают.

К фенольной фазе добавляют ацетат натрия до 1%-ной концентрации, после чего добавляют четыре объема этанола. Осадок центрифугируют, промывают этанолом и ацетоном, затем высущивают.

Пример 6. 100 г влажных бактериальных клеток, промытых 50 объемами физиологического раствора и отцеитрифугированиых, смещивают с 1000 мл свежедистиллированного 90%-ного фенола. Смесь взбалтывают в течение 1 час при 10°С и центрифугируют. Слой фенола отделяют, и к 100 мл этого слоя добавляют ацетат натрия (1%) и четыре объема 96%-иого эталона. Полученный осадок цеитрифугируют, промывают этанолом и ацетоном и высущивают.

Пример 7. 4800 г влажных нативных бактериальных клеток разбавляют в 2000 мл яичного белка и добавляют солевой раствор, доводя общий объем до 14000 мл. Суснензию выдерживают при 37°С в течение 3 час при ненрерывном взбалтывании.

13000 мл этой смеси центрифугируют при 8000 об/мин в течение 30 мин. Надосадочиую

жидкость отделяют. Осадок обезжиривают в три приема смесью в равных объемах спирта и эфира. После выпаривания получают сухое вещество.

10 г вещества разбавляют 100 мл солевого

раствора. Подкислив смесь соляной кислотой до рН 2, добавляют 100 мг Пвпсина. Смесь выдерживают в течение 4 час при 37°С, постоянно взбалтывая. Затем смесь центрифугируют при 2700 об/мин в течение 15 мин.. Надосадочную жидкость отделяют. Осадок растворяют в исходпом объеме солевого раствора, нейтрализуют от рН 7 и центрифугируют при 800 об/мин в течение 30 мин. Осадок промывает спиртом и высушивают. Падосадочпую жидкость лиофилизируют.

Предмет изобретения

Способ получения вещества, обладающего

противооп)холевой активностью, отличающийся тем, что щтамм культуры рода Lactobacillus, а именно, Lactobacillus bulgaricus var. tumoronecroticans LB -51 № 93 или № 100, Lactobacillus helveticus var. tumoronecroticans

№ 31 или Lactobacillus acidophilius var. tumoronecroticans № 43 выращивают в анаэробных условиях на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли в течение 18 - 24 час при температуре

28-50°С, цельные или разрушенные .клетки экстрагируют водой или фенолом, а целевой продукт выделяют из экетрактов либо осаждением минеральной или органической кислотой при рП 1,5-4,0, либо высаливанием, либо осаждением посредством оргапических растворителей, смепп-шающихся с водой.