Способ получения меченного тритием гуанозин-5-трифосфата Советский патент 1976 года по МПК C07H19/20 C07B23/00 

Изобретение относится к улучшенному способу получения меченного тритием биолЮгического соединения, которое может най ти применение для биологических и биохимических исследеваний. Известен способ получения меченного С гуанозин-5--трифосфата, заключающийся в том, что выращивают культуру микроорганизмов на среде, содержащей С 0.,, выделяют из биомассы меченую РНК, гидролизуют ее до нуклеотидов, разделяют их с последующим биохимическим фосфорилированием меченого гуанозин- 5 -монофосфата до меченого гуанозин-5 -трифосфата. Однако известный способ получения меченого гуанозин-5 -трифосфата позволяет получить целевой продукт только низкой удельной активности (не более 5020О м кюри/г) и с очень незначительным ходом (по суммарной активности). При этом метка по молекуле гуанозин-5 -трифосфата распределена неопределенно Целью изобретения является повышение удельной активности и радиохимической чис тоты. Для этого 8-бромгуанозин, абсорбированный на палладиевом катализаторе, подвергают обработке газообразным тритием в условиях высокочастотного электрического разряда с промежуточным выделением меченного гуанозина-8-(Т) и последующей радиохимической очисткой гуанозина- 8 (Т), совмещенной со стадией фосфорилирования. Обычно гуанозин-8(Т) выделяют на смоле Дауэкс 1x8 в формиатной форме элюапий 0,1 N растьороммуравьиной кислоты, после чего его концентрируют при помощи активированного угля. Продукты фосфорилирования гуанозина-8(Т) обычно разделяют хроматографией на ионообменном сефадексе А-2 5 в бикарбонатной форме при помощи триэтиламмоний -бикарбонатного буфера. Выход гуанозин-5 -трифосфата - 8(Т) по активности составляет 5О% (в расчете на промежуточный гуанозин - 8(Т) ). Преимуществом предложенного способа является то, что основная масса посторонней радиоактивности, не связанной с гуанозином, сбрасывается при выделении гуанозина- 8(Т). Дополнительная радиохимическая очистка происходит при концентрировании гуанозина-8(Т) на активированном угле. Наконец, наиболее тонкая и сложная очистка от продуктов радиационного поврёя дения гуанозина, хроматографически сходных с гуанозином, совмещена с процессом биохимического фосфорилирования. Благодаря высокой специфичности фермента к субстрату, радиационно-поврежден ные молекулы не фосфорилируются и связанная с ними активность легко сбрасывается в процессе разделения продуктов фос форилировалия. Пример. 145 мг 8-бромгуанозина наносят на 600 мг катализатора (10% Р на угле Норит). Тритирование проводят в стеклянной ампуле со впаянным электродом, вокруг которого помещают нанесенный на стеклянную вату катализатор с 8-брэмгуанозином. Продолжительностьтрити- роваяия в атмосфере 99%-го трития в условиях высокочастотного электрического разряда составляет 2 О мин. Температура в ам ле в процессе тритирования 12 0-130 С. По окончании процесса вещество смывают с катслизатора 60 мл спиртоаммиачной смеси (1 N раствор N Hj в 50%-м спирте) и лабильный тритий замещают на водород путем повторного изотопного уравновешивания с водой. Сухой остаток после отгонки последней порции воды растворяют в 20 мл дистиллированной воды и вводят в колонку с Дауэкс 1x8 в формиатной форме (3x30 см). Колонку промывают 250 мл дистип лированной воды, а затем выделяют гуанозин 8 (Т) в виде четкого пика при элюации - ЗОО мл 0,1 N муравьиной кислоты. Далее выделяют 8-бромгуанозин-Т ( -У ), используя для элюации 0,2 N муравьиную кислоту. В эксперименте получается - 30 мг гуанозина-8(Т) с удельной активностью 10 кюри/г (т.е. 300 мкюри), и 40 мг 8-бромгуанозина-Т ( if ) с удельной активностью 1 кюри/г (т.е. - 40 мкюри). Полученный препарат гуанозина-8(Т) концентрируют при помощи активированного угля и фосфорилируют (используя 10 мл ферментного раствора до гуанозин-5-трифосфат-8(Т) ГТФ-8(Т)). Продукты фосфорилирования разделяют на колонке (1,5x21 см), заполненной сефадексом А-25 в бикарбонатной форме. Для элюции применяют градиент концентрации триэтиламмоний-бикарбоната (от 0,2М до 0,6 М). Соответствующие фракции собирают, обессоливают при помощи сефадекса С-25 (в Н-форме) и концентрируют выпариванием в вакууме. В результате эксперимента получают 55 мг ГТФ-8 (Т) с удельной активностью ,8 кюри/г (т.е. -150-160 мкюри) .Проверка чистоты полученного препарата показала, что гуанозин-5 -трифосфат-8(Т) хроматографически однороден и радиохимически чист. формула изобретения Способ получения меченного тритием гуанозин-5 -трифосфата биохимическим фосфорилированием меченного гуанозина с пос ледующим выделением целевого продукта известным способом, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повышения удельной активности и радиохимической чистоты, . 8-бромгуанозин, абсорбированный на палладиевом катализаторе, подвергают обработке газообразным тритием в условиях высокочастотного электрического разряда с промежуточным выделением меченого гуанозина- 8 (Т) и последующей радиохимической очисткой гуанозина-8(Т), совмещенной со стадией фосфорилирования.