Способ получения меченных тритием нуклеозидтрифосфатов Советский патент 1976 года по МПК C07H19/00 C07B23/00 

1

Изобретение относится к способу получения, меченных тритием биологических соединений, которые могут найти применение в биологических и биохимических исследованиях..

Известен способ получения меченных С нуклеозидтрифосфатов, заключающийся в том что выращивают культуру микроорганизмов на среде, содержащей С 0., выделяют из биомассы меченую РНК, гидролизуют ее до нуклеотидов, разделяют их с последующим биохимическим фосфорилированием отдельных нуклеотидов до нуклеозидтрифосфатов -с.

Однако известный способ получения меченых нуклеозидтрифосфатов позволяет получать целевой продукт только низкой уделной активности с неравномерно распределенной меткой.

Предлагаемый способ получения меченных тритием нуклеозидтрифосфатов отличается от известного тем, что соответствующий галоидзамещенный нуклеозидмонофосфат абсорбированный на палладиевом катализаторе, подвергают обработке газообразным

2

тритием в условиях высокочастотного электрического разряда с промежуточным выделением меченного тритием нуклеозидмонофосфата и последующим биохимическим фосфорилированием выделенного нуклеозидмонофосфата до нуклеозидтрифосфата и радиохимической очисткой последнего, совмещенной с процессом фосфорилирования и выделением целевого продукта известным способом.

Обычно меченные тритием нуклеозидмонофосфаты отделяют от соответствующих галоидзамещенных и продуктов радиолиза на смоле Дауэкс 1x8 в формиатной форме. При этом для элюции аденозинмонофосфата, цитидинмонофосфата и уридинмонофосфата используют соответственно 0,1; 0,2 и 2, Он. муравьиную кислоту.

После этого выделенные нуклеотиды концентрируют, например, с помощью активированного угля и затем фосфорилируют до триэфосфатов ферментной системой, выделенной из бактерий Esctiefich-ia со61 . Продукты фосфорилирования обычно разделяют на ионообменной ДЭАЭ-целлюлозе А-25 в бикарбонатной форме с помощью линейного

градиента триэтиламмоний-бикарбонатного буфера. Выход по активности трифосфатов 50-70%. Поврежденные нуклеотиды и другие проду|сты радиолиза не подвергаются фосфорилированию, в связи с чем остальная радиоактивность сбрасывается при разделении продуктов фосфорилирования.

Радиохимическая чистота полученных кукле о зидтрифосфатов не ниже 99%. Высокая радиохимическая чистота препаратов достигается на последней стадии, в процессах биологического фосфорилирования и выделения препарата за счет высокой специфичности ферментов к -субстрату. Таким образом, стадии фосфоркНйРования и выделения конечного препарата с совмещены с его радиохимической очисткой.

Предлат аемый способ иллюстрируется следующим примером.

100 мг 5-Вг -цитидинмонофосфата

(5-Вг -ЦМФ) наносят на 1000 мг ката пизатора (1О% Pd на угле NOMi). Тритирование проводят в стеклянной ампуле со впаянным электродом, вокруг которого помещают нанесенный на стекловату катализатор с 5-Вг -ЦМФ. Время тритирования в условиях разряда 30 мин, температура в ампуле 120-15О°С. После окончания тритирования продукты с катализатора смывают 60 см спиртоаммиачной смеси (1 н. раствор аммиака в 50%-ном спирте). Сухой остаток растворяют в 20 см воды и вносят на колонну, заполненную смолой Да- уэкс 1x8 в формиатной форме. Колонну промывают 300 см дистиллированной воды, а затем меченный тритием ЦМФ элюируют 170 см 0,2 н. муравьиной кислоты. По- лученный препарат ЦМФ-(5Т) концентрируют на активированном угле и фосфорилируют 10 см ферментного раствора до цитидинтрифосфата (ЦТФ). Продукты фосфорилирования разделяют на колонке, заполненной ДЭАЭ-целлюлозной А-25 в бикарбонатной форме. В качестве элюэнта используют линейный градиент концентрации триэтиламмо- ний-бикарбонатногобуфера (0,01-0,21 моль/л

Концентрирование ЦТФ проводят с помо шью КМ-целлюлозы.

Формула изобрет е-н и я

Способ получения меченных тритием нук леозидтрифосфатов биохимическим фосфорилированием соответствующих меченых нуклеозидмонофосфатов с последующим выделением целевого продукта известным способом, отличающийся тем, что, с целью повышения удельной активности и радиохимической чистоты, соответствующий галоидзамешенный нуклеозидмонофосфат, абсорбированный на палладиевом катализаторе, подвергают обработке газообразным тритием в условиях высокочастотного электрического разряда с промежуточным выделением меченного тритием нуклеозидмонофосфата и последующей радиохимической очисткой последнего, совмещенной с прицессом фосфорилирования.