СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ УРИКАЗЫ Советский патент 1974 года по МПК C12N9/06 

1

Изобретение относится к области медицины, точнее к производству ферментных препаратов.

Известен способ получения уриказы, заключающийся в том, что культуру Clostridium cylindrosporum Hcl выращивают на среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли при 37°С в течение 5-7 дней, отделенные клетки промывают раствором хлористого калия и лиофильно высушивают, а затем экстрагируют фосфатным буфером рН-7,0 при 35°С, выделяют целевой продукт из экстракта путем высаливания сульфато.м аммония и последующего растворения в 0,1 Л буфере, содержащем цистеин.

Целью изобретения является разработка микробиологического способа получения уриказы, который позволяет повысить удельную активность фермента.

Поставленная цель достигается тем, что в качестве продуцента используют культуру Aspergillus flavus oryzae № 624, которую выращивают при 20-35°С и рН среды 4,0-8,0 в течение 15-60 час, отделенный мицелий замораживают при температуре от -15 до -30°С и измельчают, а экстракцию осуществляют при температуре iie выше 30°С.

Пример. Посевной материал, хранящийся на зернах риса, помещают в термостат на

9 дней при 28°С в склянках Рукса с длинным горлом емкостью 1 л до спорообразования. Затем споры с.мывают 2 л физиологического раствора при концентрации 6 г NaCl на 1 л и засевают в питательную среду, имеющую следующий состав (в кг):

Глюкоза (в куске)40

Азотнокислый натрий3

Калий фосфорнокислый0,750

Калнй первичный кислый,

фосфорнокислый0,250

Магний сернокислый (7Н20)0,500

Кальций углекислый1,0

Железо сернокислое

двухвалентное (7И2О)1,0

Кобальт сернокислый (7Н2О)10

Экстракт дрожжевой

культуры1,0

Экстракт растворимый

кукурузы0,30

Кислота мочевая0,60

Водана 1000 л

рН среды6,45 Среду стерилизуют 30 мин при 120°С. Инкубацию проводят в течение 24 час при аэрации стерильным воздухом, расход которого составляет 0,3 л на 1 л питательной среды в 1 мин, поддерживая температуру на уровне 28±1°С. После фильтрования культуральной жидкости получают 20 кг мицелия, концентрация которого равна 150 ед/г.

Мицелий промывают 40 г дистиллированной воды, после чего быстро замораживают при температуре - 20°С. Замороженный мицелий измельчают и экстрагируют 40 л аммиачной воды, имеющей величину рН 9.

После фильтрации производят концентрацию экстракта при пониженном давлении с уменьшением его объема в четыре раза. Затем концентрат обрабатывают двумя объемами ацетона и получают при этом 380 г неочищенного продукта, концентрация которого составляет 7000 ед/г.

Полученный продукт обрабатывают 3,8 л водного раствора карбоната натрия концентрацией 0,002 М, центрифугируют и заливают равным объемом насыщенного водного раствора сернокислого аммония.

Выпавщий осадок центрифугируют, обрабатывают водным раствором углекислого натрия. Концентрация полученного продукта составляет 0,002 М.

Нерастворивщуюся часть осадка удаляют центрифугированием. Раствор после этого деминерализуют путем

его пропускания через колонку «Sephadex G-25 с использованием в качестве буферного соединения раствора углекислого натрия концентрацией 0,002 М, после чего полученные таким образом активные элюаты стерилизуют пропусканием через мембрану Tillipore GS с последующей лиофильной сущкой.

Выделяют 57 г готового продукта, концентрация которого соответствует 49000 ед/г.

Предмет изобретения

Способ получения уриказы путем выращивания культуры-продуцента в аэробных услоВИЯХ на среде, содержащей исто.чники углерода, азота и минеральные соли, экстракции культуры водой или буфером при нейтральном или слабощелочном рН и выделения и очистки целевого продукта из экстракта известными приемами, отличающийся тем, что, с целью получения фермента с высокой удельной активностью, в качестве продуцента используют культуру Aspergillus flavus oryzae № 624, которую выращивают три 20-35°С и

рН среды 4,0-8,0 в течение 15-60 час, отделенный мицелий замораживают при температуре от -15 до -30°С и измельчают, а экстракцию осуществляют при температуре не выще 30°С.