СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФЕРМЕНТНОГО ПРЕПАРАТА ЛИПОКСИГЕНАЗЫ Российский патент 2004 года по МПК C12N9/02 C12N1/14 C12N9/02 C12R1/69 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в хлебопекарной промышленности.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому эффекту является способ получения ферментного препарата липоксигеназы путем глубинного культивирования ее продуцентов - грибов рода Aspergillus: A. oryzae 3-9-15 или A. awamori 466 на питательной среде, содержащей в качестве источника углерода соевую муку и минеральные соли азота, фосфора, калия и магния; а в качестве индуктора - соевое масло. Активность липоксигеназы, определяемая каротиноксидазным методом, составляет 20000-50000 усл. ед на 1 см культуральной жидкости (а.с. СССР № 88542, МКИ С 12 N 9/02 / Способ получения ферментного препарата липоксигеназы /P.P.Токарева, Е.А.Двадцатова, М.В.Соловьева, В.Л.Яровенко, В.Л.Кретович, Е.В.Будницкая; №2949321 /28-13; заявл. 30.05.80; опубл. 15.08.83, Бюл. №30).

Недостатком известного способа является высокая каротиноксидазная активность ферментного препарата, при которой разрушаются биологически активные вещества муки - каротиноиды.

Техническая задача изобретения - получение ферментного препарата липоксигеназы с высокой активностью образования гидроперекисей и низкой каротиноксидазной активностью.

Техническая задача достигается тем, что в способе получения ферментного препарата липоксигеназы, включающем подготовку питательной среды, глубинное культивирование штамма-продуцента, новым является то, что в качестве штамма-продуцента ферментного препарата липоксигеназы используют Rhizopus oryzae 605, а при подготовке питательной среды в нее вносят, мас.%: соевый жмых 2,0-2,5 и подсолнечное масло 0,7-0,9 в качестве органических питательных веществ, кукурузный экстракт 0,8-1,0 в качестве источника ростовых факторов, минеральные соли - гидрофосфат натрия 0,4-0,6, дигидрофосфат аммония 0,8-1,2, начальное значение рН среды 7,0.

Технический результат изобретения выражается в синтезе ферментного препарата с высокой липоксигеназной и низкой каротиноксидазной активностью, позволяющего получать хлебобулочные изделия высокого качества.

Способ реализуется следующим образом.

Штамм-продуцент Rhizopus oryzae 605 получен из Всероссийской коллекции микроорганизмов РАН, где хранится под номером ВКМ F-605.

Чистую культуру выращивают на агаризированном сусле с содержанием сухих веществ 4% в течение 3-4 суток при температуре (30±1)°С.

Подготовка питательной среды заключается в следующем. В воде растворяют минеральные соли дигидрофосфат аммония в количестве 0,8-1,2 мас.% и гидрофосфат натрия 0,4-0,6 мас.%; добавляют, мас.%: кукурузный экстракт 0,8-1,0, соевый жмых 2,0-2,5, подсолнечное масло 0,7-0,9. Начальное значение рН среды доводят при необходимости до 7,0. Затем среду стерилизуют 1 ч при 0,1 МПа, а потом охлаждают.

Подготовленную таким образом питательную среду, содержащую соевый жмых, подсолнечное масло, кукурузный экстракт, дигидрофосфат аммония, гидрофосфат натрия и воду инокулируют спорами штамма-продуцента Rhizopus oryzae 605 и выращивают при температуре 30-32°С и аэрации в течение 72 ч.

После окончания выращивания штамма-продуцента культуральную жидкость отделяют от биомассы фильтрованием. Ферментный препарат ли-поксигеназы получают осаждением изопропиловым спиртом (его концентрация 62 об.%) при минус 2 - минус 4°С. Осадок ферментного препарата высушивают под вакуумом.

В предлагаемом изобретении ферментный препарат липоксигеназы оценивают по липоксигеназной и каротиноксидазной активности (Оганесян Н.А., Борисова И.Г., Соломатин Д.А., Будницкая Е.В. Изоферментный состав и активность ЛО некоторых сортов пшеницы вида Triticum aestivum //Докл. АН СССР. 1983. Т.269. №4. С.1002-1005).

Метод определения липоксигеназной активности основан на измерении количества образующихся конъюгированных гидроперекисей жирных кислот, регистрируемых при длине волны 234 нм на спектрофотометре и являющихся конечными продуктами окисления субстрата. Состав реакционной смеси: 0,2-0,3 см³ раствора субстрата, 0,5 см³ раствора фермента, 5 см³ 0,05 М фосфатного буфера. Длительность реакции 1-2 мин, она прекращается при разведении 1 см³ реакционной смеси в 5 см³ 60%-ного этилового спирта. Для приготовления контрольной пробы к 1 см³ реакционной смеси через 5-10 с от начала реакции добавляли этиловый спирт.

В качестве субстрата использовали линолевую кислоту.

За единицу липоксигеназной активности принимали изменение экстинции на 0,001 за 1 мин, отнесенное к 1 г препарата.

Метод определения сопряженного окисления β-каротина в присутствии линолевой кислоты, основанный на измерении оптической плотности реакционной смеси, содержащей β-каротин, при длине волны 440 нм регистрирует степень разрушения каротина промежуточными продуктами окисления жирных кислот при участии липоксигеназы. Для получения раствора β-каротина к 40 мг его добавляют 150 см³ смеси этанола и ацетона, взятых в соотношении 1:1. Реакционная смесь состоит из 4 мл 0,05 М фосфатного буфера, 0,2-0,3 см³ раствора каротина, 0,2-0,3 см³ раствора субстрата (Оганесян Н.А., Борисова И.Г., Соломатин Д.А., Будницкая Е.В. Изоферментный состав и активность ЛО некоторых сортов пшеницы вида Triticum aestivum //Докл. АН СССР. 1983. Т.269. №4. С.1002-1005), 0,2-0,5 см³ раствора фермента. Реакцию проводят 60 с; затем добавляют в реакционную среду 1,0 см³ 1 М раствора NaOH. В контроле щелочь вносится в реакционную среду перед введением фермента.

За единицу каротиноксидазной активности принимали изменение оптической плотности на 0,001 за 1 мин.

Особенность штамма-продуцента и состав питательной среды для его культивирования обеспечивают биосинтез липоксигеназы с высокой липок-сигеназной и низкой каротиноксидазной активностью.

Способ поясняется примерами.

Пример 1. Готовят питательную среду следующего состава, мас.%:

Соевый жмых 1,8

Масло подсолнечное 0,5

Кукурузный экстракт 0,6

NH₄H₂PO₄ 0,6

Na₂HPO₄ 0,2

Вода Остальное

Для инокуляции среды готовят водно-споровую суспензию штамма-продуцента Rhizopus oryzae 605. Для этого скос 4-суточной культуры в пробирках 18×180 мм заливают 10 см³ стерильной воды и смывают споры. В колбы Эрленмейера емкостью 750 см³ вносят по 100 см³ питательной среды, которую засевают водно-споровой суспензией в количестве 1% к объему среды. Выращивание продуцента проводят на качалке при скорости 1,7-1,8 с^-1, температуре (30±2)°С в течение 72 ч. Затем мицелий и взвешенные частицы отделяют от культуральной жидкости фильтрованием.

Ферментный препарат получают осаждением изопропанолом с концентрацией 62 об.% при температуре минус 2 минус 4°С. Препарат высушивают под вакуумом.

Активность липоксигеназы составляет 285700 ед/г, каротиноксидазная - 19800 ед/г.

Пример 2. Готовят питательную среду следующего состава, мас.%:

Соевый жмых 2,0

Масло подсолнечное 0,7

Кукурузный экстракт 0,8

NH₄H₂PO₄ 0,8

Na₂HPO₄ 0,4

Вода Остальное

Культивирование штамма-продуцента Rhizopus oryzae 605: приготовление споровой суспензии, инокуляция посевного материала, выращивание, отделение мицелия, осаждение ферментного препарата, определение активности липоксигеназы проводят аналогично примеру 1.

Полученный ферментный препарат имеет активность липоксигеназы 336400 ед/г, каротиноксидазная активность составляет 22600 ед/г.

Пример 3. Готовят питательную среду следующего состава, мас.%:

Соевый жмых 2,5

Масло подсолнечное 0,9

Кукурузный экстракт 1,0

NH₄H₂PO₄ 1,2

Na₂HPO₄ 0,6

Вода Остальное

Культивирование продуцента: приготовление споровой суспензии, инокуляция посевного материала, выращивание, отделение мицелия, осаждение ферментного препарата, определение активности липоксигеназы проводят аналогично примеру 1.

Полученный ферментный препарат имеет активность липоксигеназы 356800 ед/г, каротиноксидазную 26400 ед/г.

Пример 4. Готовят питательную среду следующего состава, мас.%:

Соевый жмых 2,7

Масло подсолнечное 1,2

Кукурузный экстракт 1,2

NH₄H₂PO₄ 1,4

Na₂HPO₄ 0,8

Вода Остальное

Культивирование продуцента: приготовление споровой суспензии, инокуляция посевного материала, выращивание, отделение мицелия, осаждение ферментного препарата, определение активности липоксигеназы проводят аналогично примеру 1.

В полученном ферментном препарате активность липоксигеназы - 315200 ед/г, каротиноксидазная активность - 19100 ед/г.

Как видно из примеров, при культивировании Rhizopus oryzae 605 на питательной среде состава, мас.%: соевый жмых 2,0-2,5; масло подсолнечное 0,7-0,9; кукурузный экстракт 0,8-1,0; (NH₄)₂HPO₄ 0,8-1,2; Na₂HPO₄ 0,4-0,6, дает максимальный эффект (примеры 2 и 3). По сравнению с известным способом активность липоксигеназы выше, а окисление β-каротина происходит в меньшей степени.

Таким образом, предложенный способ позволяет получить ферментный препарат липоксигеназы, обладающий высокой активностью образования гидроперекисей и низкой активностью окисления β-каротина, что важно для улучшения физических свойств теста в хлебопечении и одновременно сохраняет биологически ценные вещества муки.

Пример 5. Использование препарата липоксигеназы в технологии приготовления хлеба майского. Рецептура и режим приготовления теста представлены в табл.1.

Ферментный препарат дозируется в количестве 0,015% к муке в тесте. Предварительно он растворяется в воде и вносится в тесто при замесе. Показатели качества хлеба майского представлены в табл. 2.

Использование такого препарата в хлебопечении улучшает физические свойства теста - вязкость возрастает, адгезия уменьшается. Улучшаются такие показатели качества хлеба, как удельный объем на 18-25%; формоустойчивость на 11-15%; пористость на 7-10% (табл. 2).

Особенно важно применение препарата при переработке муки со слабой клейковиной. По основным характеристикам клейковина, отмытая из теста с внесением липоксигеназы, переходит из разряда удовлетворительно слабой в разряд удовлетворительно крепкой. При этом сохраняются биологически активные вещества муки - каротиноиды.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в хлебопекарной промышленности. Способ предусматривает глубинное культивирование штамма продуцента липоксигеназы Rhizopus oryzae ВКМ F-605 на питательной среде следующего состава: соевый жмых, подсолнечное масло, кукурузный экстракт, дигидрофосфат аммония, гидрофосфат натрия и воду с последующим выделением ферментного препарата. Изобретение позволяет синтезировать ферментный препарат с высокой липоксигеназной и низкой каротиноксидазной активностью, а также улучшает качественные характеристики хлеба. 2 табл.

Способ получения ферментного препарата липоксигеназы, предусматривающий глубинное культивирование штамма–продуцента на питательной среде, содержащей органические питательные вещества, источник ростовых факторов, минеральные соли и воду с последующим выделением ферментного препарата, отличающийся тем, что используют штамм-продуцент Rhizopus oryzae ВКМ F-605, культивирование ведут на питательной среде, содержащей в качестве органических питательных веществ соевый жмых, подсолнечное масло, в качестве источника ростовых факторов – кукурузный экстракт, минеральные соли – дигидрофосфат аммония, гидрофосфат натрия при следующем содержании компонентов, мас.%:

соевый жмых 2,0-2,5

подсолнечное масло 0,7-0,9

кукурузный экстракт 0,8-1,0

гидрофосфат натрия 0,4-0,6

дигидрофосфат аммония 0,8-1,2

вода остальное