СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НУКЛЕОЗИДФОСФАТОВ И САХАРОФОСФАТОВ Советский патент 1974 года по МПК C12P19/30 C12P19/44 

1

Изобретение относится к способам получения нуклеозидфосфатов и сахарофосфатов и может быть использовано в различных областях биохимии и медицины.

По основному авт. св. № 413188, известен способ получения нуклеозидфосфатов и сахарофосфатов путем биологического фосфорилирования фосфорилирующей смеси, состоящей из сахара, аденозина, нуклеозидов или нуклеозидмонофосфатов, неорганических фосфатов, хлористого калия, хлористого магния, воды при рН 6,5-7,0 в присутствии биологического катализатора с последующей очисткой продукта.

С целью повышения ферментативной активиости биологического катализатора и чистоты получаемых продуктов дополнительно с экстрактом водорослей в фосфорилирующую смесь вводят плазмолизированиые пивные дрожжи в соотнощении 1 : 2. .

Способ заключается в следующем.

В .качестве биостимуляторов - ферментов применяют экстракт водорослей, приготовленный размельчением водорослей (в соотношении сухие водоросли - вода, как 1 :3) с последующим выдерживанием в течение 3 ч при температуре 4°С.

Полученный экстракт водорослей прибавляют в фосфорилирующую смесь, состоящую из сахара, нуклеозидов или нуклеозидмонофосфатов, неорганических фосфатов, хлористого калия и магния, пивных дрожл ей, толуола, сахара и воды при 37°С и рН 6,5-7,0 Реакция продолжается 0,5-2,5 ч. Для прекращения реакции фосфорилирования используют 10%-ный раствор трихлоруксусной кислоты при -7°С. Для осаждения иуклеозидфосфатов применяют метиловый или этиловый спирт в 7-10-кратном объеме.

Для получения сахарофосфатов в качестве биостимуляторов применяют экстракт водорослей. Препарат получают в виде кальциевых и бариевых солей. В дальнейшем способ поясняется примерами его исполнения.

Пример 1.

200 мг аденозипа растворяют в 7,6 мг воды. Прибавляют Ма2ПРО}-12Н2О (натрий фосфорнокислый двухзам.) и КН2РО4 (калий фосфорнокислый однозам.) в процентном соотпощении 3,5:1; 0,014 КС1 (калий хлористый), 0,014 г MgCl2-6H2O (магний хлористый), 0,4 г технического сахара, 0,6 мг толуола, 7,6 мл пивных дрожжей, экстракта зеленых водорослей. Содержание белка 20 мг.

Время ферментации 3 ч при температуре

36-38°С при pli 6,5-7,0. Для прекращения

реакции прибавляют 2 г трихлоруксусной кислоты при 0°С. Отцентрифугируют осадок. К

фильтрату прибавляют 10-кратный объем метилового спирта. Оосадок разделяют на ионообменной колонке.

Выход: 0,156 г 96% АТФ (аденазинтрифосфорная кислота).

Пример 2.

200 мг аденозин-5-монофосфорной кислоты растворяют в 7,6 мл воды.

Прибавляют Na2HPO4-12Н20 (натрий фосфорнокислый двухзам.) и КН2РО4 (калий фосфорнокислый однозам.) в процентном отношении 2,5:0,7; 0,014 г КС1 (калий хлористый), 0,014 г MgCl2-6n20 (магпий хлористый), 0,4 г технического сахара, 0,6 мл толуола, 7,6 1МЛ пивных дрожжей экстракта зеленых водорослей (приготовленного в день работы). Содержание белка 20 мг.

Время ферментации 3 ч при температуре 36-38°С при 6,7-7,0 рН. Для прекращения реакции прибавляют 2 г трихлоруксусной кислоты при 0°С. Отцентрифугируют осадок. К фильтрату прибавляют 10-кратный объем метилового спирта. Осадок разделяют па ионообменной колонке.

Выход: 0,12 г 95% АТФ.

Пример 3.

200 мг 15 ГМФ (гуанозин монофосфорная кислота) растворяют в 7,6 мл воды.

Прибавляют Na2HPO4-12Н20 (натрий фосфорнокислый двухзам.), КН2РО4 (калий фосфорнокислый однозам.) в процентном отношении 2,5:0,7; 0,014 г КС1 (калий хлористый), 0,014 г MgCl2-6H2O (магний хлористый), 0,4 г технического сахара, 0,6 мл толуола, 7,6 мл иивных дрожжей, экстракта зеленых водорослей (приготовленного в день работы). Содержание белка 10 мг.

Время ферментации 2.5-3 ч при температуре 36-38°С при рН 6,5-7,0.

Для прекрашения реакции прибавляют 2 г трихлоруксусной кислоты при 0°С. Осадок

отделяют центрифугированием. К фильтрату прибавляют 10-кратный объем метилового спирта. Осадок разделяют на ионообменной колонке.

5 Выход 0,1 г 90% ГТФ (гуанозинт.рифосфорная кислота), 0,1 г 90% ГДФ (гуанозиндифосфорная кислота).

Пример 4. К 54 г сахара прибавляют

10,5 г фосфорнокислых солей, 100 г нивных

0 дрожжей, 300 мл воды, экстракта зеленых

водорослей (пирготовленного в день работы).

Содержание белка 180 мг.

Раствор перемешивают 2-3 мин, затем выдерживают в течение 15 мин при температуре 36-37°, после чего добавляют 13,5 мл толуола.

Время ферментации 1,0-1,5 ч. Процесс ферментации прекращают прибавлением 50 мл 50%-ного раствора трихлоруксусной кислоты. Центрифугируют. К. центрифугату добавляют 21 г Ва(СНзСОО)2 и насыщенный раствор Ва(ОП)2 до слаборозового окрашения по фенолфталеину. Реакционную смесь центрифугируют.

Бариевую соль дифосфата фруктозы промывают 1 раз 50%-ным спиртом, 1 раз 96-градуспым спиртом. Сушат в вакууме эксикаторе.

Выход: 50 г бариевой соли 1,6 - дифосфа0 та фруктозы.

Предмет изобретения

Способ получения нуклеозидфосфатов и сахарофосфатов по авт. св. № 413188, отличающийся тем, что, с целью повышения ферментативной активности биологического катализатора и чистоты полученных продуктов, дополнительно с экстрактом водорослей в фосфорилирующую смесь вводят плазмолизироваиные пивные дрожжи в соотношении 1:2.