Способ получения бактериальных амилаз Советский патент 1983 года по МПК C12N9/32 C12N1/20 

Изобретение относится к области промыш| лешюй микробиологии, а именно к техноло4 гни получения бактериального ферментного препарата амипосубтилина, который широко Применяется в животноводстве, пищевой и легкой промьшшенности. Известны способы получения бактериальных амилаз путем культивирования продуцентов на питательных средах, содержащих источники углерода, азота, фосфора, магния, калия, натрия, кальция, микроэлементы и необходимые факторы роста (кукурузный экстракт, гидролизаты дрожжей) И). Известен также способ получения бактериальных амилаз путем глубинного культивирования бактерий в жидкой аэрируемой среде следующего состава, вес.%: крахмал 24,0; кукурузный экстракт (50% с.в.) - 1,20; сухие пивные дрожжи 0,24; лактоза 0,30; магний сернокислый 0,015; калий сернокислы 0,30; аммоний фосфорнокислый 2-х замещенный 0,84; натрий хлористый 0,03; медь сернокислая 0,00039; окись кальция 0,012; кальций углекислый 0,03; амилосубтилин ГЭХ 0,165; вода до 100 мл, рН 6,2-6,4 t2J. Недостатками известного способа является . длительность процесса (56-70 ч) и недостаточно полное использование источника углерода. Известно, что с увеличением концентрации питательных веществ абсолютный выход продукта увеличивается, но степень потребления, например, углеродсодержащих веществ снижается. Увеличить выход продукта от внесенных питательных веществ возможно за счет оптимизации условий культивирования. Целью изобретения является увеличение выхода целевого продукта, повышение эффективности использования углеродсодержащего субстрата и сокращение времени ферментации... Поставленная цель достнгается тем, что согласно способу получения бактериальных амилаз путем глубинного культивирования бактерий рода Bacillus в жидасой питательной аэрируемой среде, содержащей источник углерода, азота, необходимые факторы роста. 3 а также минеральньге соли и воду, в питател ную среду перед культивированием одновременно с посевным материалом дополнительно вводят неорганический восстановитель снижающий Е h среды, в количестве 0,0010,05 вес.%, а также тем, что в качестве неорганического восстановителя -используют феррицианид калия или гипосульфит натрия, или тиогликолит натрия. Добавление восстановителей в среду снижает окислительновосстановительный потенциал на 60-40 мВ. Положительный эффект наблюдается только в том случае, когда восстановитель добав ляют в начале культивирования и не отмечае ся при добавлении его в последующие фазы роста продуцента. В качестве продуцента о-амилаз используют промышленнЬш продуцент Bacillus subtilis SK - 52. Культивирование продуцента проводят в условиях аэрации на про изводственной питательной среде следующего состава, %; крахмшт 10 и 24; кукурузный экстракт (50% с.в.) 1,20, сухие пивные дрожжи 0,24; лактоза 0,30; магний сернокислый 0,015; калий сернокислый 0,30; аммоний фосфорнокислый 2-х замещенный 0,84; натрий хлористый 0,03; медь сернокис лая 0,00039; окись кальция 0,012;. кальций углекислый 0,03; амилсубтилин ГЗХ 0,165; рН 6,2 - 6,4. В питательную среду перед. культивированием одновременно с посевным материалом внося г восстановитель в количестве 0,001-0,05%. Выращивание проводят в колбах на качалке при t 37° С в течение 48 ч на среде с 10% и 69 ч на среде, содержащей 24% крахмала. Пример 1. Односуточную культуру Bacillus subtilis SK-52 выращенную на картофельных столбиках, пересевают в жидкую ферментационную среду, содержащую, вес.%: крахмал 10,0; кукурузный экстракт (50% с.в 1,20; сухие пивные дрожжи 0,24; лактоза 0,30; магний сернокислый 0,015; калий сернокислый 0,30; аммоний фосфорнокислый 2-х замещенный 0,84; натрий хлористый 0,03; медь сернокислая 0,00039; окись кальция 0,012; кальций углекислый 0,03, амилосубтилин ГЗХ -165; вода до 100 мл. Одновременно с посевом вносят и 0,001% феррицианид калия в виде стерильного водяного раствора. При добавлении вос становителя ОВН среды снижается на 40 мВ по сравнению с его уровнем в контроле в среде без восстановителя. Выращивание продуцента проводят в кол бах с 50 мл среды на качалке при t 37°С. Через 48 ч культивирования определяют выход фермента. 2 В условиях сниженного ОВП выход амилаз на 27,6% выще, чем в контроле. Пример 2. При выращивании того же продуцента Bacillus subtilis SK-52 в условиях примера 1, но отличающихся тем, что количество восстановителя в среде 0,01%, а ОВП среды - на 60 мВ ниже,чем в контроле. Через 48 ч культивирования выход амилаз на 33,3% выще чем в контроле. Пример 3. При выращивании бактерий Bacillus subtilis SK-52 в условиях примера I, но отличающихся тем, что крахмал вносится в среду в количестве 24%, а восстановитель - 0,01%. Через 48 ч ферментации выход амилаз на 27,8% превыщает выход в контроле и достигает такого уровня, который наблюдается в контрольных условиях только через 69 ч культивирования. Через 69 ч ферментации выход амилаз в условиях сниженного ОВП среды превышает выход в контрольных условиях на 24,4%. Пример 4. При культивировании бактериального продуцента амилаз Bacillus subtilis SK-52 в условиях примера 1 на среде с 10% крахмала, но отличающихся тем, что в среду в качестве восстановителя используют гипосульфит в количестве 0,05%. Уровень ОВП ферментационной среды при этом снижается на 55 мВ. Через 48 ч ферментации выход амилаза в опытных условиях на 28,4% выще, чем в контрольных (без восстановителя). Пример 5. При культивировании Bacillus subtilis SK-52 в условиях примера 1, но отличающихся тем, что в среду вносят в качестве восстановителя тиогликолят натрия в количестве 0,001% через 48 ч ферментации выход в опытных условиях на 22,6% выще,чем в контрольных (без восстановителя). Результаты суммированы в таблице. Добавление восстановителя в количестве 0,05-0,001% на 60-40 мВ снижает ОВП среды и позволяет увеличить выход бактериальных амилаз на 28% через 48 ч культивирования, а через 69 ч - на 52,2%, т.е. в этих условиях происходит более эффективное использование источника углерода. На средах с повышенным содержанием крахмала (24%) и с восстановителем, уже через 48 ч ферментации уровень амилазной активности культуральной жидкости такой, какой в контрольных условиях (без восстановителя) достигается только через 69 ч ферментации. Таким образом, реализация изобретения позволяет увеличить выход готового продукта, повысить эффективность использования углеродсодержащего субстрата и сократить время ферментации.

Контроль Опыт 0,001 (K4Fe(CN)6 0,01

Опыт 0,05 (+гипосульфит)

Опыт (+ТИОГЛИКОЛЯТ

натрия) 0,001

Эффект (среднее значение)

Формула изобретения

1. Способ получения бактериальных амилаз путем глубинного культивирования бактерий рода Bacillus в жидкой питательной аэрируемой среде, содержащей источники углерода, азота, необходимые факторы роста, а также минеральные соли и воду, отличающийся тем, что, с целью увеличения выхода готового продукта, повыщения эффективности использования углеродсодержащего субстрата и сокращения времени ферментации, в питательную среду перед культивированием одновременно с посевным материалом дополнительно вводят неоргани128,5

100

152,2

127,8

52,2

27,8

ческий восстановитель, снижающий Eh среды, в количестве 0,001-0,05 вес.%.

2. Способ по п. 1, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что в качестве неорганического восстановителя используют феррицианид калия или глиносульфат натрия, или тиогликолят натрия.

Источники информации, принятые во внимание прн экспертизе

1.Калунянц К, А. и Голгер Л. И., Микробные ферментные препараты. Пищевая . промышленность. 1979, с. 10-28.

2.Промыщленный регламент по производству ферментного препарата амилсубтилина. Г10Х, ГЭХ, 25.09.79.