СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОМАССЫ Советский патент 1974 года по МПК C12N1/20 A23K1/00 

Изобретение относится к микробиологической промышленности.

Известны способы получения биомассы, используемой в кормовых и пищевых целях, заключающиеся во внесении посевного материала- микроорганизмов, выбираемых из родов Pseudomonas, Bacillus и Methanomas, в водную питательную среду, культивировании посевного материала и отделении биомассы от культуральпой среды.

При этом культивирование посевного материала осуществляется на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и необходимые для роста микроограниЗМов минеральные соли. Однако такие способы не обеспечивают получение биомассы, богатой аминокислотами, протеинами и витаминами так эффективно, как предлагаемый способ.

Цель изобретения - обогащение биомассы перечисленными веществами и более полное использование питательной среды.

Это достигается тем, что источник углерода вносят в питательную среду непрерывно после достижения оптимальной фазы развития микроорганизмов, а в -качестве источника углерода иопользуют смесь метана с кислородом.

При этом отделение биомассы от культуральной среды осуществляют одновременно с внесением источника углерода в питательную

среду, а часть среды подвергают рециркуляции.

В рециркулируемую культуральную среду вводят растворы минеральных солей в концентрациях, меньших первоначально добавляемых. При этом источник азота вводят в виде газообразного аммиака, гидрата окиси аммония или солей аммиака.

Получение биомассы по предложенному способу осуществляют следующим образом.

В водную питательную среду .при рП от 6 до 7,5 вносят посевной материал.

Питательная среда содержит по меньшей Мере 0,005 г/л иона магния, 0,0025 г/л иона кальция, 0,001 г/л иона железа, а также источник азота в .виде вышеперечисленных добавок.

Засеянную питательную среду выдерживают при температуре 20-40°С.

После достижения оптимальной фазы развития микроорганизмов в выдержанную питательную среду при ее перемешивании непрерывно вводят газообразную смесь из метана и кислорода.

Эта смесь -может содержать 3-97 об. % кислорода и 1-97 об. % метана.

.При этом одновременно с непрерывной подачей газообразной смеси производят непрерывный отвод из ферментатора жидкой ереды, отделение биомассы от культуралыюй среды и рециркуляцию ее части в ферментаторе.

В состав рециркулируемой среды перед лодачей ее в ферментатор вводят растворимые соли магния и аммония. При этом растворимые соли аммония добавляют в количестве, обеспечивающем суммарную концентрацию иона аммония, образуемого за счет нодачи газообразного аммиака и упомянутых растворимых солей аммония, составляющую 0,1 - 5 г/л.

Для отделения биома.ссы от культуральной среды отводимую из ферментатора жидкую среду с кислотным продуктом фильтруют с последующей его промывкой жидкостью из воды и растворов солей.

Промытую таким образом биомассу высущивают на воздухе при комнатной температуре или путем ее нагревания до температуры, не превышающей 105°F при атмосферном или пониженном давлении.

Посевным материалом могут служить микроорганизмы, например, из АТСС 21310 рода

Pseudomonas, который способен окислять метан и природный нефтяной газ в составе питательной среды, содержащей только одни минеральные соли, для получения биомассы с высоким содержанием аминокислот, протеинов и витаминов.

Данную культуру можно выделить в чистом виде с использованием среды, содержащей названные минеральные соли, из смешанной культуры АТСС 19385.

Микроорганизмы АТСС 21310 культивируют на различных средах, содержащих минеральные соли, источники азота и углерода.

В качестве последнего может быть метан или природный нефтяной газ в смеси с кислородом или воздухом с добавлением углекиского газа или без него.

Скорость роста АТСС 21310 равна нулю при 20 и 40°С, умеренная при 25°С и имеет оптимальное значение при температурах 30- 38°С.

Предпочтительные составы питательных сред для АТСС 21310 приведены в табл. 1.

Таблица 1

Среды А-Г пригодны для проведения культивирования по периодическому методу, а среды Д-Ж для непрерывных процессов.

Контроль за величиной рН при непрерывном процессе осуществляют яутем раздельного добавления кислоты или щелочи.

Пример 1. Для определения влияния различных концентраций иона аммония на концентрацию продукта микроорганизма АТСС 21310 культивируют на среде А с различными концентрациями сульфата аммония.

Концентрацию продукта определяют -через 166 час -при 420 Ммк три териодичеокой подаче питающей смеси газа из 56% метана и 44% кислорода.

При непрерывной подаче газовая смесь состоит ИЗ 50% метана и 50% кислорода.

При проведении 15 опытов (7 - при непрерывной Подаче газа и -8-три периодической подаче газа) в -каждом отдельном случае применяют различную концентрацию сульфата аммония в пределах от О до 10 г/л.

Максимальный выход АТСС 21310, а также максимальное содержание протеина в продукте установлено на средах с концентрацией сульфата аммония в пределах 0,5-3,5 г/л.

Пример 2. Культуру микроорганизма АТСС 21310 выращивают на среде А при непрерывном перемешивании и возрастающем добавлении NaOH или (NH2)SO4 для поддержания рН среды в пределах 6,0-7,5, являющейся оптимальной для роста данного микроорганизма. 1 г NaOH и 1 г NH4SO4 добавляют в 50 мл среды на 140 час 0,75 г NaOH и 1 г NH4S04 в 10 мл среды - на 168 и 185 час.

Состав питающего газа: 49% метана и 52% кислорода при его подаче 87 мл/мин через барботер.

При указанных условиях, -близких к непрерывной ферментации, выход клеточного материала превышает 5 г/л.

Пример 3. Серию культур выращивают при перемешивании и комнатной температуре на среде А с различными источниками азота.

В качестве источников азота используют азотнокислый натрий, азотнокислый аммоний, гидрат окиси аммония, азот и сернокислый аммоний.

В качестве источника углерода используют газовую смесь из 40% метана, 40% кислорода и 20% азота под давлением 0,141 кг/см.

Полученные результаты показывают, что содержание нротеина у клеток тгримерно одинаково и независимо от выбранного источника азота. Ион аммония обеспечивает более короткие промежутки времени удвоения, более высокие плотности клеточного материала и более высокую степень утилизации азота по сравнению с одним нитрат - ионом или нитрат - ионом совместно с ионом аммония.

Пример 4. Исследуют влияние снижения концентраций иона магния в среде А.

Культуру АТСС 21310 получают в колбах в среде А, в которой концентрации ионов магния были понижены до 20, 40 и 60% от суммарного содержания редкоземельных элементо-в в обычной среде А.

В соответствии с .полученными данными выход АТСС 21310 снижается при уменьшении концентрации ионов магния более, чем на 50% против обычно содержащихся в среде А.

Пример 5. Среду, не содержащую клеток, извлекают после каждого из одинаковых опытов по ферментации. В каждом случае анализируют на содержание элементов металлов путем атомной абсорбционной спектрометрии. Полученные данные сравнивают с соответствующими данными анализа для свежей среды А.

Сравнение показывает, что ион магния постепенно поглощается клетками по мере прохождения (Процесса ферментации. Следовательно, рециркулируемую среду необходимо пополнять ионом магния до подачи в фер:ментатор при работе яо непрерывному методу. Другие

Культуру микроогранизма выделяют через 640 час культивирования.

Результаты исследова«ия клеток и сравнительные данные, получаемые во время, форментации на среде с различными источниками азота, приведены в табл. 2.

Таблица 2

ионы металлов не потребляются клетками в значительной степени и добавления этих ионов не требуется.

При последующих опытах удаление микроэлементов, иных чем магний, вызывает дополнительное понижение роста и выхода АТСС 21310. Удаление иона магния приводит, в основном, к прекращению роста, что свидетельствует с важности иона .магния.

Результаты

этих опытов приведены в табл. 3 и 4.

20

Таблица 3

25

Примечание. Среда 3 представляет собой среду А, содержащую 10 % компонентов в виде микроэлементов (CaCIj, FeSOi-THaO, MnSOi-HaO, MoOj); среда И не содержит микроэлементов; среда К не содержит микроэлементов, а также MgSO4-7HjO. Все среды готовят на дистиллированной воде.

В табл. 4 дана оценка модификаций qpeды А. Примечание. Оптическая плотность для двух культур. Условия ферментации: ферментацию проводят при комнатной температуре в 200 мл среды, состав которой приведен в табл. 3. Исходная газовая смесь содержит, об. %; метан 40, кислород 40, азот 20. Давление поддерживают на уровне 0,281 кг/см колбы. Пример 6. Исследуют влияние концептрадии иона магния на рост микроорганизма. Проводят серию ооытов, при которых АТСС 21310 культивируют в модифицированной среде А, которая содержит MgSO4-71 20 в количествах от 0,0 до 2,0 г/л среды. Условия ферментации: комнатная температура, 100 мл среды А с заданными концентрациями MgSO4-7H2O; исходная газовая смесь, содержащая, %: метан 40, кислород 40, азот 20. Давление поддерживают на уровне 0,28 КГ/СМ2. Результаты, .полученные при .проведении серии опытов, доказывают, что чем выше концентрация MgSO4-71-120, тем интенсивнее происходит рост микроорганизмов. При этом было установлено, что входящие в состав среды ионы кальция или железа, используемые в виде ра.створимых солей, существенно- снижают скорость роста и выход биомассы. Ионы молибдена и марганца могут быть удалены без торможения роста. Пример 7. Исследуют влияние состава исходного цитающего газа на скорость роста микрооргаиизма. Опыты проводят ;по выращива нию АТСС 21310 с использованием исходной газовой смеси следующего состава, %: Опыт 1 метан 3, кислород 97. О.ПЫТ 2 метан 40, кислород 40. Опыт 3 метан 97, азот 20, кислород 40. Ферментацию проводят в колбах по 1000мл при комнатной темлературе в 500 мл среды А. Исходный газ подают под давлением 0,281 кг/см2. Повторное заполнение колб газом проводят ежедневно.

Таблица 4 определяется для каждой переменной величины и является средней При приведенных выше периодических условиях проведения опытов установлено, что при оодаче газовой смеси, содержащей 97 об. % кислорода, роста по существу не наблюдается. При исходной газовой смеси, содержащей 97 об. % метана отмечается лишь умеренный рост. Исходная смесь, содержащая равные объемы метана и кислорода явственно способствует повышенным скоростям роста. При этом установлено, что предпочтительные составы газовой смеси, способствующие более высоким скоростям роста, соответствуют примерно стехиометрическим количествам растворенных в жидкой среде метана и кислорода. Могут применяться смеси, содержащие не менее 3 об. % кислорода и не более 97 об. % кислорода. Пример 8. Этот пример иллюстрирует случай рециркуляции культуральной среды, извлекаемой из ферментатора. Перемещиваемую культуру Methonomonas methanica, выращенную в среде В, выдерживают при 25°С и непрерывной подаче газовой смеси, состоящей из природного нефтяного газа и воздуха в соотношении 20 : 80. В логарифмической фазе выращивания культуру выдерживают до тех пор, пока плотность клеточного материала не достигает 1,0 г/л. После этого среду извлекают и биомассу отделяют фильтрованием и центрифугированием. Затем регенерированную среду возвращают в ферментатор, где ее повторно засевают дозой отделенного клеточного материала. Концентрация MgSO4-7H2O, (NH4)2SO4 в регенерированной среде, направленной в ферментатор, поддерживают на уровне 1,00 и 1,50 г/л путем периодического внесения в нее соответствующих добавок. Биомасса микроорганизма АТСС 21310 по ее питательной ценности нрибл.ижается к соевой рыбной муке. Сравнительный аминокислотный состав протеина, полученного из метана, а также из соевой и рЫбной муки приведен в табл. 5. Таблица 5 По разности; Отдельные определения. Предмет изо бретения 1. Способ получения биомассы, используемой в кормовых и пищевых целях, путем впе510 15 20 25 30 севия посевного материала из родов Pseudomonas Bacillus, Methanomas в водную питательную среду, содержащую источники углерода, азота и необходимые для роста микроорганизмов минеральные соли, культивирования .посевного материала и отделения биомассы от культуральной среды, о т л .и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью обогащения биомассы аминокислотами, протеинами и витаминами и более полного использования среды, внесение источника углерода осуществляют непрерывно с наступлением оптимальной фазы развития микроорганизмов, используя в качестве источника углерода смесь метана с кислородом, при этом одновременно с внесением его в питательную среду осуществляют отделение биомассы от культуральной среды, отвод последней и рециркуляцию ее части в процессе выращивания. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что питательную среду перед введением в нее источника углерода выдерживают При 20- 40°С и рН 6,0-7,5. 3.Способ .по пп. 1 и 2, отличающийся тем, что источник азота вводят в .виде газообразного аммиака, гидрата окиси аммония или солей аммония. 4.Способ по пп. 1-3, отличающийся тем, что в рециркулируемую среду вводят необходимые минеральные соли в концентрациях, меньщих первоначально добавляемых солей, вводя необходимые их растворы.