жащей цефалос.порин С, может быть также частично концентрированный, обработанный метанолом фермента ционный бульон, содержащий цефалоспорин С. Эту водную среду здесь называют «неполностью обработанный бульон.
Водная среда, содержащая цефалоспорин С, может также получаться из раствора цефалоспорина С, который был обработан одной пли несколькими -ионообменпьими смолами для частичной очистки pa-criBopa цефалоспорина С. Эту всаную среду здесь называют «элюат смолы цефалоопорина С. Источник и чистота водной среды, содержащей цефалоопорин С, до некоторой степени влияют на количество анлидрида алкановой кислоты, iKiOTOpoe исп-ользуют для ацилирования амяиогруппы в цефалоспорине С.
Если ацилирование ведут необработанным бульоном, то обычно на 1 эквивалент цефалоспорина С идет 8-9 эквивалентов ангидрида кислоты. ЕСЛИ применяют частично конценгри.рованный неполностью обраб|0тан ный бульон, то на 1 эквивалент цафалоспорина С идет 4- 6 эквивалентов ангидрида кислоты. Если используют растворы цефалоспорина С в элюатах смолы, то на 1 эквив-алент цефалаапорз-пна С идет 1,5-3 эквивалента ангидрида кислоты.
Из ангидридов кислоты, которые можно применять для осущест1Ви1ения предлагаемого способа, можно назвать ангидриды пропяоновой, масляной, валериановой и «апроновой кислот, смещанные алкаиовые и галоидалкаHGBbie ангидриды, например хлсруксусиопрошионовый ангидрид, хлоруксусноуксусный ангидрид, б/ромужсуснопроп-лонавый анпидрлд, а также такие бис-галоидал-кановые ангидриды, как хлоруксусный ангидрид, дихлоруксусный ангидрид, бромуксусный ангидрид, хлорпропионовый ангидрид, хлормасляный ангидр.ид и т. о.
Первую стадию способа, т. е. стадию ацилирования, ведут при рН 7-11, предпочтительно при рН 8,5-9,5. рИ среды можно поддерживать при тщательном контроле реакции и добавлении основания по мере того, как рН снижается за счет образования кислоты в реакции ацилирования. Кроме того, рН можно поддерживать за счет -применения буферных растворов, например бората натрия или борной кислоты, дополняемых едким натром. К другим буфернЫМ реагентам можно отнести карбонатно-бикарбонатную буферную систему, приготовленную «з натриевых или калиевых солей, ИЛИ фосфатные буферы. Ацилирование ложно вести при любой температуре от температуры замерзания смеси до -30°С, желательно температуру смеси поддерживать при 10- 20°С, лучше При 15-20°С. Такую тематературу можно поддерживать соответствующим охлаждением, если это необходимо.
По окончании стадии ацилирования реакционную омесь обрабатывают Х|Инолином, изохйнолином или эквивалентным им основанием при избытке по отнощению к количеству цефалоспорина С в водной смеси. Обычно применяЮТ 1,5-12 эквивалентов хинолина на 1 эквивалент N-ацилцефалоопорИна С. Лучще употреблять не менее 2 эк1внвалентов хинолина на 1 эквИшалент цефалоспорина С, хотя можно применять и большие .количества хинолина. Обычно для полной реакции Н-ап)илированного цефалоспорина С достаточно 2-4 эквивалентов хинолина на 1 эквивалент цефалоспорина С.
Ио окончании добавления хинолина К водной реакционной смеси цефалоспорина С рН среды до)эодят до 2,0-3,5 с помощью подкисляющего реагента, например серной кислоты или соляной ййслоты. Исходя из экономически-х соображений, лучще применять для этих целей серную кислоту. При таком рН среды реакционную смесь держат при перемещивании при О-30°С, лучше при 10-20°С, в течение 1 чао, Обычио около 20 мин, до начала кристаллизации. По окончании процесса кристаллизации хинолиновую смесь N-ацилцефалоспорина С выделяют из водной реакционной смеси обычным способом, например центрифу.гираванием или фильтрованием, промывают водой, затем органическим раствор;ителем, например этилацетатом, сущат соответствующим образом, например в кипящем слое в течение час при 60°С до остаточного содержания воды 3% (определяют метэдо1М Карла Фищера).
В начале этого процесса лучше применять водную жидкость, содержащую цефалоспорин С, с мощностью 30 000-50 000 по никотинамидному методу (30-50 мг/мл) или 40000-60000 мкг/мл по ультрафиолетовому методу (40-60 мг/мл). При больщмх мопхностях в исходной .водной ж,пдкости получаются слищком густые суспензии ХИНОЛИ1НОБОЙ соли N-ацилцеф алоспорина С, которые трудно обрабатывать. При меньших мощностях может наблюдаться медленная кристаллизация и также остается сульфат натрия в продукте, если низкая мощ.пость вызвана разбавлением смеси буферами элюирования смолы. Концентрирование илИ разбавление раствора можно осуществлять до или после ацилкрования. Наиболее хорощей водной жидкостью, содержащей цефалоспорин С, является жидкость, содержащая мощность 40000-45000 мкг/мл (по никотинамидному методу) или 50 000-55 000 мкг/мл цефалоспорина С (по ультрафиолетовому методу).
Для поддержания рП среды на стадии аци-лирсвания лучще пр.именять гидроокись натрия с буфером из буры, при соотнощении 4,5 моль гидроокиси натрия на 3 моль тетрабората натрия. Концентрация гидроокиси натрия может быть до 8 моль (25%), концентраЦИ1Я буры 1 моль. При ацилировании оптимальный рН среды равняется 9, при рП 7,5- 10,5 получаются более низкие выходы.
Наиболее приемлемой температурой ацйлирования является температура не выще 20° С. Менее желательны температуры выше 25° С и .ниже 15° С. Реакцию ацилирования заканчивают в течение 2-2,5 мин, но для обеспечения полноты реакции обычно ведут ее в течение 10-15 мин.
В некоторых случаях бывает «еобходимо Храйить реакциоиную смесь М-ащилированного цефалоапорина С ,из-за графика кристаллизаци.и или ПО другим причинам. В этом случае для увеличения стабильности .смеси ее рН доводят до 5,0-5,5 с -помощью 30%-1ной серной кислоты и охлаждают до 10-15° С во время 5йранения.
Хинол.инсеая соль М-ацилированного цефалоспорина С образуется с хорошими выходами пр.и наличии 2-6 моль хинолина .на 1 моль цефалоспорина С (по ультрафиолетовому способу) .
Кристаллическую хинолиновую соль Nацилцефалоспорина С лучше 1промывать водой для удаления заг-ряз1нений, большая часть которых ;раствори,ма в воде, наП1ри,мер боратов, сульфатов, продуктов ги1дрол.:иза ан.гидрида, избытка х.инол.ина и растворимых примесей. После водной промывки кристаллическую соль лучше (промывать этилацетатом для удаления органических примесей и для частичного удаления воды из осадка на фмльтре. Это дает осадок, который легче сушить. Водоомешиваюш:иеся растворители (спирты, ацетон, ацетонитрил) нельзя применять для иромывки, так как их водные растворы частично растворяют продукт и приводят к уменьшению выхода и к ПЛОХОЙ обрабатываемости осадка 1на фильтре.
Ос-адок ХИИОЛ.ИНО.ВОЙ соли -ацилц.ефалоспорина С можно сушить обычными методами, лучше в кипяшем слое в течение 1,5-3 час ври 60°С до о.статочиого содержания воды 3,5% и меньше (по методу Фишера).
Пример 1. 500 мл водного элюата смолы, содержащего 33,0 мг цефалоспорина С в 1 мл, ацилируют, до-бавлял 42 мл раствора хлсруксуснонроиионового ангидрида в этилацетате (2 эквивалента ангидрида по цефалоспорину С). Температу.ра смеси около 20°С, рН смеси около 9,0 поддерж.ивают с помощью буфера из бората натрия (60 мл). По окончании ацилирования добавляют 25,2 мл хинолина и рН доводят до 3,3 с ломощью 61 мл 30%ной серной кислоты. Смесь перемешивают в течение 4 час для обеопечения окончания реакции, охлаждают до 15° С и ф.ильтруют. Кристаллическую х.инолинавую соль N-ацили.рованного цефалоопорина С -промывают водой и сушат в течение ночи в вакууме при 40° С. Выход составляет 22,4 г, чистота продукта 97,1%, это соответствует выходу 86% из элюата смолы.
Пример 2. Кристаллизация в водной среде как предпочтительный метод получения хииолинозой соли -ацилированного цефалоспорина С из фильтрованного бульона.
Часть фильтрата, полученного из цельного бульона ферментации .цефалоспорина С, обработанного 13 г октадекагидрата сульфата
алюминия и 10 мл 6,6%-ного полиэтиленимина на 1 л бульона, содержащего 25,8 г цефалоспорина С, обрабатывают 2 объемачми метанола на 1 .объем фильтрата.
Осадок отфильтровывают и выбрасывают. Фильтрат упаривают до объема 530 мл. Сконцентрированный фильтрат охлаждают до 10° С и ацилируют 105 мл хлоруксуснолропиоHOBO.ro ангидрида (5 эквивалентов ангидрида
на 1 эквивалент цефалоспорииа С). рН смеси поддерживают 9,0 с помощью 145 мл боратного -буфера. По окончании ацилирования добавляют 39 мл хинолина. рН смеси доводят до 2,9 с помощью 105 мл 30%-ной серной кислоты. Подкисленную смесь пере.мешивают в течение 30 мин во цремя кристаллизации хинолиновой соли N-а.цилцефалосиорина. Смесь охлаж.дают до 15°С, фильтруют и промывают водой. После суш-ки в вакуу.ме при 40° С в
течение «очи получают 32,5 г кристалл:ической ХИ1НОЛИНОВОЙ соли N-ацилцефалоспорина, чистота продукта 95,4% (ультрафиолетовый анализ), выход 81,5% из фильтрованного бульона.
П р им е р 3. К раствору 21,0 г борной кислоты в 2000 мл раствора натриевой соли цеф алоспорина С, смешанного с ацетатом .натрия, содержащего 40,4 мг/мл цефалоспор.ина С, называемого водный раствор элюата смолы
с буфером из бората натрия, добавляют в течение 10 мин раствор 50,6 г пролионового ангидрида в 160 мл этилацетата для .блокирования азота аминогруплы. Темиературу поддерживают 15-20° С с помощью во дяной бани,
рН 8,5-9,0 - с помощью 257о-ного раствора едкого натр.а. Когда рН устанавливается (приблизительно через 3 мин после окончания добавления анги.-дрида), его доводят до 2,5 с (ПОМОЩЬЮ 30%-ного раствора серной кислоты,
затем добавляют 75 г облегчающего фильтрование вещества. Смесь фильтруют и к фильтрату доб-авляют 91,5 г хинолина. рН снова доводят до 3,5 с ломощью серной кислоты и раствор перемешивают 30 мин при комнатной
температуре. Смесь охлаждают в течение ночи (5° С). Осадок хинол.иновой сол« цефалоспорина С отфильтровывают, гфомьивают водой и сушат Б в-акууме при 40°С. Вес осадка 81,2 г (чистота 97,6%.), вы.ход 84,6% из элюата смолы.
Предмет изобретения
1. Способ выделения цефалоспорина С из водных растворов путем обработки этих растBopOiB ацилирующим агентом, отличающийся тем, что, с целью упрощения процесса, водный раствор, содержащий цефал.о порпш С, обрабатывают а«гид ридо.м кислоты формулы
0
Л-С
X
О
/ ч Й-С
О
где R - алкильная группа, содержащая 1-5 атомов углерода, или галоидалкильная группа, содержащая 1-5 атомов углерода;
R- алкильная группа, содержащая 1-5 атомов углерода или галоидалиилиная группа, содержащая 1-5 атомов углерода, причем галоид :в галоидалкильной группе, папример, хло.р или бром,
при тем пературе О-30°С ,и ,рН 7-11 с последующей обработкой -полученной лри этом реакционной смеси, содержащей N-ацияцвфалоспорин С, .молярным .избытком хкволина или изохинолина по отнощению к.М-ацилцефалоспорину С с до,веде.нием рН смеси до 2,0- 3,5 с помощью подкисляющего реагепта, выдерживапием полученной смеси при О-30° С и последующ-им .выделением образо-вавщейся кристаллической хинолиновой соли К-ацилцефалоапорина С известными приемами.
2.Способ по и. 1, отличающийся тем, что в качестве исходной смеси нопользуют смесь с конце нтрацией цефалоспорина С в водной среде от 30 до п|рибл.из1ительно 50 мг1мл вод.ной смеои.
3.Способ по п. 1, отличающийся тем, что процесс на стадии ацилирования проводят при 10-20° С.
4.Способ тто П. 1, 2 и 3, отличающийся тем, что исходную водную среду, содержащую
цефалоспарни С, предварительно обрабатывают одной или более ионообменными смолами для частичной очистки.
5.Способ ио ли. 1, 2 и 3, отличающийся тем, что ,в качестве исходной водной среды, содержащей цефалоапор.ин С, шр именяют частично концентрированный ферментационный
бульон цефалоспарина С, обработанный метаНОЛОМ.
6.Способ .по 1ПП. 1, 2 и 3, отличающийся тем, что в качестве исходного водного раствора, содержащего цефалоспорин С, используют необработанный фильтрованный ферментационный бульон цефалоспорина С.
7.Способ ло пп. 1-6, отличающийся тем, что в качестве ангидрида кислоты .шрименяют хлору1ксусно1пропио1новый .ангидрид.
8.Слюсоб 1ПО пп. 1-7, отличающийся тем, что .рН среды на стадии ацил.ирова1ния поддерживают 8,5-9,5.
9.Способ ;по етп. 1-8 отличающийся тем, что Х.И1НОЛ.ИН доба.вляют в 1количест1ве 2-4 эквивалента хинолина на каждый эквивалент Nацил:цефалоспорина С.
10. Способ по п. 7, отличающийся тем, что ангидрид кислоты добавляют ъ количестве 30 1,5-3 эквивалента, ангидрида на каждый эквивалент цефалоапорина С.
