Способ получения антибиотика Советский патент 1980 года по МПК C12D9/14 

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБИОТИКА

Изобретение относится к области микробиологии к касается получения а тибиотиков, обладающих ингибирукщим действием. Предложенный антибиотик новый и способ его получения в научно-технической и патентной литературе не опи сан. Целью изобретения является получе ние антибиотика общейформулы 5-CH2-CH,-NH-CO-CH Да ОI где R, - водород, металл, алкил или трифенилметил. Достигается это тем, что штамм Streptomyces А 271 выращивают в аэроб ных условиях в питательной среде, со держащей источники углерода и азота и минеральные соли, при.рН 4,0-9,0 и 20-40 С с последующим выделением целе вого продукта в виде кислоты или в ви де сложного эфира, или соли. Штамм Streptomyces выделен из почвенного образца, собранного недалеко от храма Eiheiji в районе Voshida пре фектуры Fukui в Японии, обозначенный номером А 271. Культура депонирована в Fermentation Research 3nstitute, Agency o JndustriaE Science and Techno ogie, где онахранится под HOiepOM PERM - P .№ 3984. Образец организма Streptomyces A 271 депонирован также институтом АТСС под № 31358. Морфологические признаки. Развет-г . вленность полученного мицелия простая, верхняя часть его образует крюки,петли или неполные спирали. Эти формы наблюдаются при культивировании на среде из овсяной муки и глицерин-аспарагиновой агаровой среде, в то время как прямые или.же изогнутые формы обычно образуются на среде из дрожжевого и солодового экстрактов, Форма овальная или цилиндрическая/ причем эти споры образуют цепь, состоящую более чем из 10 (обычно 10-50) спор. Размер 0,8-1,0 х 1; 0-1,8 мк, поверхность гладкая, не наблюдается ни жгутиков, ни спорангиев. На воздушном мицелии образуются гифы. Культуральные признаки штаг.ма Streptomyces А 271 приведены в табл 1,

Цвет воздушного

Рост

Среда мицелия

Снетло-оранжево- Сильный -желтЕлй

Бледно-оранжевоТо же -желтый до светло-оранжево-желтотого

Бледно-оранжевоа-желтый до светло-оранжево-желтого

- -

Бледно-оранжево-желтый до светло-оранжево-желтого

.Бледно-оранжево-желтый до светло-оранжево-желтого почти не определенный

Бледно-оранжевОт желтый до светлооранжево-желтогота

Бледно-ора нжевый

й до светло-оранжево- хсел того Физиологические характеристики. Растет и развивается при 10-40-с, оптимальной является 20-30°С. Желатину разжижает при 20°С; крахмал гидролизует, молоко пептонизирует, но не коагулирует. Образует меланоидные пигменты на пирозиновом агаре, на пептоновом дрож жевом железистом агаре и в бульоне из триптоно-дрожжевого экстракта. Хо рошо усваивает арабинозу, ксилозу, глюкозу, рамнозу, плохо усваивает сахарозу. Совсем не усваивает фруктозу, инозитол, раффинозу, маннитол. Новый антибиотик получают путем инокулирования спор мицелия штамма . Streptomyces А 271 в аэробной питательной среде. В качестве питательной среды используют источники углерода, азота, неорганические соли. В качестве источников углерода берут глюкозу, глицерин, мальтозу, сахарозу, мелассу, декстрин, крахмал, ма ляН|Ые или жировые источники углерода такие как масло земляных орехов. При нес бходимости добавляют источники азота, пептон, мясной экстракт, муку из соевых бобов, масло из семян хлоп чатника, сушеные дрожжи, жидкость от замочки кукурузы, дрожжевой экстракт, казеин от снятого молока, нитрат натрия, нитрат аммония, сульфат аммония, неорганические соли; дикаТабл-ица 1

Цвет мицелияРастворимый-субстрата пигмент

Светло-желтый светло-оранжевожелтый

Светло-желтый

Светло-желтый до слегка желто-розового

Светло-оранжево-желтый до светло-желтого

Светло-оранжево-желтый до коричневато-желтогобледно-желтый

Светло-оранжево-желтый до бледно-коричневого

Светло-желтый лийфосфат, хлористый натрий, карбонат кальция, сульфат магния, а также следы металлов, например кобальта, марганца. Для предупреждения вспенивания во время ферментации добавляют, ajiивспениватели, силиконовое и растительное масло..Среду можно стерилизовать перед культивированием, рН доводят до 4-9, предпочтительно 6-8 до или после стерилизации. Культивирование проводят в аэробных условиях. Используют методы встряхивания в колбах или выращивание ведут в погруженном состоянии. Температура ферментации колеблется от 20 до 40С, предпочтительно от 25 до . рН культурального бульона во время ферментации доводят до 4-9, предпочтительно 6-8. Ферментацию ведут до тех пор, пока не сконцентрируется достаточное количество антибиотика. Обычно ферментация длится от 30 до 90 ч, хотя этот период колеблется в зависимости от состава среды, температуры ферментации, штамма. Количество скопившегося антибиотика в Ферментационном бульне определяют биоиспытательным методом и биоавтографией.

Скопившийся антибиотик растворим в воде и находится в основном вне мицелия, поэтому мицелий удаляют после ферментации известными способами, фильтрацией центрифугированием, экстракцией с последующим выделением аи- 5 тибиотика из фильтрата.

Для регенерации и.выделения антибиотика применяют экстрагирование при низком рн с применением растворителя, этилацетата, Н-бутанола или с обрат- Q ной экстракцией из слоя растворителя в водный слой при более высоком рН, экстракции при нейтральном рН с применением растворителей; хлористого метилена, хлороформа или в присутст- ,ВИИ липофильной четвертичной аммониевой соли, как бензалконийхлорид тетра-н-бутил-аммонийгидросульфат с обратной экстракцией из слоя растворителя, содержащего йодистый натрий, йодистый калий.20

Адсорбцию ведут на активированном угле или высокопористых стиролдивинилбензольных смолах, как амберлит и

элюирование - водным метанолом, водным ацетоном, гель-фильтрацию - с применением сефадекса, хроматографию- на колонне или тонкослойную хроматографию с применением целлюлозы, силикагеля, глинозема, а осаждение путем добавления растворителя - ацетона. 30

Антибиотик обладает широким спектром антибиотического действия, оказывая сильное действие протиб различных . бактерий, например грам-положительных, таких как StaphyEococcus, DipEo-35coccus. Streptococcus, Sarcina, Ba- ciEPus, и грАм-отрицательных, относящихся к родам ACcaCigenes, Comamonas, Escherichia, KEebsieEBa, Proteus, Citrobacter, Enterobacter, Serratia. 4Q Антибиотик обладает свойством повышать антибиотическое действие других антибиотиков, таких как пенициллинн ,, и цефалоспорины, а также Citrobacter, frendii, Proteus vu garis, Entero- 5 bacter aerogenes, Serratia marcescens.

При введении мышам, зараженным патогенными грам-положительными бактери- ями, антибиотик оказывает значительное терапевтическое действие.сп

При введении мьоиам внутрибрюшинным путем в количестве 500 мг/кг антибиотик не оказывает смертельного действия у подопытных животных.

Так как антибиотик более устойчив В виде соли, чем в виде свободной кислоты, то в фармацевтических целях его используют предпочтительно в вие соли.

В качестве солей антибиотика ис

пользуют соли щелочных металлов (нат- 6 рия, калия, лития), щелочноземельных

(кальция и магния), а также соли других металлов - алюминия, соль аммония, первичные, вторичные или третич;-ные амины (моноэтиламин, диметиламин, 65

триметиламин, моноэтаноламин, диэтаноламин), соли с органическими основаниями, как бензатин, прокаин.

Пригодными солями для фармацевтических целей являются соли щелочных металлов, натрия, калия.

Антибиотик представляет собой одноосновную кислоту, содержащую карбоксильную группу в молекуле. Поэтому из антибиотика можно получить различные сложные эфиры с различными спиртами, меркаптанами .или их производными; поступают при этом аналогично способу применяемому для известных антибиотиков на основе клавулановой кислоты или тиенамицина.

По изобретению соответствующим сложным эфиром антибиотика является сложный эфир общей структурной формулы

S - СН J- СН J-NH -СО-СНз

CHj-CHj.

(II

-N

COOR

1

где R, низкая алкильная группа . или трифенильная группа.

В приведенной структурной формуле (II) низшая алкильная группа обозна.чает группу с разветвленной или неразветвленной цепью, в частности алкильную группу с числом атомов С менее б, а именно группу с числом атомов С от 1 до 4. К ней относятс я метил, этил, н-пропил, изопропил, и-бутил, изо-бутил, н-пентил, изо-пен тил, н-гексил и др.

Согласно изобретению сложные эфиры приведенной структурной формулы (II) могзт быть получены взаимодействием антибиотика структурной формулы (1)-или его солей с соединениями общей структурной формулы

(III)

КУ

где R имеет -то же значение, что и выше, а Y - атом или группа, которые . можно расщепить.

Что касается атомов или групп, выражаемых символом Y в формуле (III), то примениь ыми являются любой вид атомов или групп, которые поддаются расщеплению при контактировании с карбоксильной группой антибиотика,, например атомы галоидов, хлор, бром или йод, сульфонилоксигруппы, карбонилоксигруппы реакционноспособного характера, как -O-CO-CF,j и т. п. Предпочтительнымиявляются атомы галоида.

.Примерами соединения приведенной структурной формулы (III) являются: метиловый спирт, йодистый метил, диметилсульфат, метилмерка:птан, этанол, бромистый этил,.йодистый этил, этилмеркаптан, н-пропилхлорид,. н-пропилйодид, пропиловый спирт,изо-пропиловый спирт,изо-пропилбромид, -бутиловый спирт , н -бутилбромид-, н -бутилйодид, и-пентиловый спирт, н-пентил-1 хлорид, Н-пен1албромид, н-пентилйодид, Н гексиловый спирт, н-гексилбромид, Н-гексилйодид, тритиловый спирт, тритилмеркаптан, тритилхлорид, тритилбромид и т. п. Одним из примеров низших диаэоалканов, пригодных для получения сложных эфиров антибиотика является диазометан. Взаимодействие антибиотика с соединениями общей структурной формулы (III) или с низшими диазоалкв-намн мО лгет быть осуществлено известными способами, применяемыми при этерификации в сложный эфир. Так, например , взаимодействие антибиотика с соединеПИЯМИ общей структурной формулы (III или с низшими диаэоалканами предпочтительно осуществляют в инертной жидкой среде, хотя его можно вести и без нее. В качестве такой среды можно применять углеводороды, как бензол, толуол, Н-гексан, циклогексан и галогензамещенные углеводороды, как хлороформ, хлористый метилен или дру гие амидыр как диметилформамид, гексаметилфосфортриамид или другие ,,диметилсульфоксид, эфиры, как диэтиловый, диизопропиловый, ди-и-бутиловый тетрагидрофуран, диоксан или другие. сложные эфиры, как этилацетат, Н -бут ацетат или другие, кетоны, как ацетон метилэтилкето.н или т. п. Эти раствор 1е.ли использовать в отдельност или в виде смесей двух или нескольки из них. Температура реакции может колебать ся в пределах диапазона в зависимости от рода соединений общей структурной формулы (III), вида низшего диазоалкана рода жидкой среды или используемых продуктов . Температуру реакции можно выбирать в диапазоне, в котором антибиотик не разлагается, заметно, од нако, , предпочтительно применяют температуру порядка ниже 60°С, предпочтительно, 0-40С, более предпочтител но, мелщу 5°С и комнатной температурой. При осуществлении этой реакции можно добавлять стимулирующий реак, цию реагент, как триметиламин, триэтиламин, пиридин, дициклогексилкарбодиимид, или др. В этих условиях ре акция может быть завершена за 1-24 ч обычно 3-12 ч. Согласно предпочтительному Всфиан ту изобретения антибиотик, применявMbij для взаимодействия с реакционноспособным производным структурной фо мулы III, где R - трифенилметил,. не обязательно должен представлять собой выделенный очищенный продукт. Дл реакции может найти применение . кул тивированный продукт или профильтрованный бульон после удаления мицелия из культивированного продукта и сырой препарат антибиотика, частично очищенный регенерацией и вьаделением частично очищенным препаратам относятся, например, концентрированный злюат из активированного угля, которым обрабатывают профильтрованный бульон; концентрированный элюат из стиролдивинилбензольной смолы, как Diaion НР-20, которым обработан профилированный бульон, обессолен- ный концентрат с активированным углем элюата, полученного ступенчатой концентрацией хлористого натрия в фосфатном буфере из ионообменной смолы, например QAE-Sephadex, на котором адсорбирован концентрированный элюат из Diaion НР-20, концентрированный метиленхлоридный экстракт в присутствии бензалконийхлорида, концентрированный экстракт с хлороформом в присутствии сго 7П-соединений; концентрированный бутаноловый экстракт при низком рН (3,5) и низкой температуре. Полученный таким образом антибиотик-тритиловый сложный эфир выделяют- из реакционной смеси и очищают рядом известных способов. По окончании реакции реакционную смесь вначале выливают в водную среду для удаления водных примесей, как побочные продукты и т. д. Предпочтительно в качестве водной средыприменяют нейтраль ный буфер, чтобы значение рН приближалось к нейтральному. Антибиотик тритиловый сложный эфир, экстрагируют малополярным органическим растворителем, в основном, не смешивающимся с водой, как этилацетат, бензол, хлороформ и т. п. в течение ступени экстрагирования в целях его улучшения можно добавлять соль: хлористый натрий, сульфат аммония или т.п., По высушивании органического экст.ракта безводным сульфатом натрия тритиловый сложный эфир выделяют из растворителя известными методами, например гель-фильтрацией с применением продуктов как Bio-Beads S-X3, Sephadex LH-20 или адсорбционной хроматограс ией с применением носителей, как силикагель, глинозем, фуллерова земля, Хритиловый сложный эфир далее очи щают кристаллизацией из растворителя или смеси растворителей, как бензол, толуол, ксилол, этилацетат, диэтиловый эфир, хлористый метилен, хлороформ, гексан, петролейный эфир (кипящий в диапазоне 30-60С). Среди сложных эфиров общей структурной формулы (III), которые можно, псшучить вышеприведенными способами, антибиотик тритиловый сложный эфир структурной формулы (П-а) S- cHi-cHj- iH-co-cHj Hj-CHj является одним из наиболее полезHbik так как он более устойчив по сравне нию с антибиотиком структурной форм лы (I), его легче выделить, причем он сохраняет сильное антибиотическо действие и ингибирующее р)лактамаз действие, в то время как тритиловый сложный эфир известных пенициллинов не оказывает какого-либо ощутимого антибиотического дейстЗвия. Далее, этот тритиловый сложный эфир структурной формулы (и-а) очень важен в качестве одного из активных сложных эфиров и полезного промежуточного продукта для синтезирования других фармацевтических полезных продуктов поскольку тритиловуюгруппулегко отщепить . БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА АНТИБИОТИКА,ТРИТИЛОВОГО СЛОЖНОГО ЭФИРА Тритиловый сложный эфир антибиотика обладает широким спектром антибиотического действия, в частност против ряда различных грам-положительных бактерий родов DipCococcus, Streptococcus, Staphy6ococcus, Sarcina, BaciCBus и тому подобных органиэмов, а также грам-отрицательных бактерий родов ABcaBigenes, Comamona к т. п. Тритиловый сложный эфир антибиоти ка также оказывает хорошее, действие против грам-отрицательнык бактерий родов Escherichia, KEebsietEa, Proteus. Существенной отличительной чертой тритилового сложного эфира антибиоти ка является сильное действие против храм-отрицательных бактерий, устойчи вых против антибиотиков, обладающих 1 -лактамовой кольцевой структурой и относящихся к родам Citrobacter, Proteus, Enterobacter, K ebsiet6a, Serratia. Тритиловый сложный эфир антибиотика также обладает свойством повы.шать антибиотическое действие других антибиотиков, в частности (i-лактамо вых антибиотиков, как пенициллинов и цефалоспоринов, против образующих fr-лактамазу бектерий, как Citrobacte f eundii, Proteus vuEgaris, Enterobacter aerogenes., Serratia marcescen Тритиловый сложный .эфир антиб о и ка при введении мышам, зараженным па тогенными грам-положительными бактер (ями, оказывает значительное терапевксйческое действие. Тритиловый сложный эфир при введении внутрибрюшинньм путем мышам в количестве 500 мг/кг не вызывает смерти подопытных животных. Антибиотик и его производные, в частности тритиловый сложный эф-ир, оказывают в пробирке и на живом организме действие на грам-отрицательные и грам-положительные микроорганизмы и вследствие этого полезны при борьбе с бактериальными инфекциями и их предупреждении в организмах подопытных животных. Антибиотик или его тритиловый сложный эфир и соответствующие составы могут быть введены орально, местно или парентерально (внутривенно, внутримышечно, внутрибрюшинно и т. д.) и могут найти применение в целом ряде различных фармацевтических препа- |ратов в зависимости .от способа введения. Так, например, антибиотик или его тритршовый сложный эфир можно . , сочетать с фармакологически совместиit/sbiM носителем, разбавителем в твердом виде (например в виде таблеток, , порошков, гранул, покрытых саха,ром таблеток, лепешек, порошков для распьшения, суппозиториев и т. д.), в полутвердом виде (например в виде мазей, кремов, полутвердых капсул и, так далее), в жидком виде (например, в виде жидких растворов, эмульсий, , взвесей, лосьонов, сиропов, раствор.ов для инъецирования, жидких растворовдля распыления и т. д.). Единичная доза, содержащая антиби- отик, или его тритиловый сложный эфир может содержать 0,1-99% по весу активного компонента в любом виде;- жидком, полужидком и твердом, i Таблетки и капсулы для орального. введения могут быть получены в виде единичных доз и содержать связывающие агенты, например сироп, аравийскую камедь, желатину, сорбитол, тригакант, поливинилпирролидон, или наполнители, например лактозу, сахарозу,, крахмал, фосфат кальция, сорбитол, глицин или смазывающие агенты, например стеарат магния, полиэтиленгликоль, тальк, кремнезем или другие; агенты распада, например картофельный крахмал; смачивающие агенты - лаурилсульфат натрия или др. -Таблетки могут быть покрыты в соответствии с общеизвестными методами. Жидкие препараты могут быть получены для орального введения в виде масяных или водшлх суспензий, раствоов, эмульсий, сиропов и так далее, или же их можно изготавливать в виде ухих прсйуктов, которые разбавляют одой или другими соответствующими носителями перед введением. Вышеприеденные жидкие препараты для орального введения.могут содержать следующие фармацевтически совместимые .ингредиенты; суспендирующие ингредиенты (например, метилцеллюлозу, сорбитоловый сироп, сахарный сироп, оксиэтилцеллюлозу, желатину, карбоксиметилцеллюлозу, гель стеарата алюминия, гидрогенированные съедобные жиры и масла), неводные носители (например, этиловый спирт, пропиленгликоль, маслянистые сложные эфиры, фракционированное масло кокосового ореха, миндальное масло); эмульгирующие агенты (например, лецитин на ос нове аравийской камеди, сорбитановый моноолеат); консервирующие средства (например, метил-п-оксибензоат, пропил-п-оксибензоат, сорбиновую кислоту) . Суппозитории-могут содержать обыч ные основные продукты для этих средс как масло какао и различные глицерид Инъекционные составы могут быть получены в виде единичных доз в ампу лах или многодозовых емкостях с соде жанием консервирующего средства. Они могут иметь форму суспензий, растворов и эмульсий в маслянистых или вод ных носителях, а в соответствующем случае могут содержать суспендирующие или диспергирующие агенты и стабилизаторы. Антибиотик может быть по лучен в виде порошка, который можно комбинировать с непирогенной стериль ной водой перед применением. Составы, содержащие антибиотик или его тритиловый сложный эфир, могут быть получены в различных формах пригодных для адсорбции через слизис тую оболочку носа, горла, а также бронхов. Так, например, для этой цел предпочтительными являются порощки или жидкие растворы для распыления, ингаляционные препараты, лепешки, полоскания для горла и так далее, Для лечения глаз и ушей антибиотик изготавливают в виде отдельных капсу для ввода по каплям в жидком или полужидком виде. Для местного применения пригодны препараты на гидрофобвой или гидрофильной основах, как п рошки, лосьоны, кремы, мази. Составы могут содержать ингредиенты, например, консервирующие, про тизоокислительные, смазывающие, при дающие вязкость, ароматизирующие, суспендирующие, связующие, стабилиз ющие продукты. В случае использования антибиот ка и/или его тритилового сложного эфира для лечения инфекций в оргс1низ ме свиней, коров, овец, кур препсфатЦ могут быть получены в виде срегдст расположенных внутри молочной железы на основе веществ замедленного или скорого действия, например в виде концентратов для добавления в корм, Фармацевтические составы согласно изобретению могут содержать антибио -тик или его тритиловый сложный эфир виде единственного активного инредиента или же в сочетании с иными терапевтически действенными ингредиентами. Так как антибиотик и его тритиловый сложный эфир обладают синергистическим действием на различных образующих fb-лактамазу бактерий в сочетании с ib -лактамовыми соединениями, их целесообразно комбинировать в . фармацевтических составах с Ь-лактамовыми соединениями. В качестве подходящего р -лактамового соединения используют бензилпенициллин, феноксипенициллин, карбенициллин, ампициллин и амоксициллин; а также производные цефалоспорина, как цефалоридин, цефалотин, цефазолин, цефалексин, цефокситин, цефацетрил, цефамондол, цефапирин, цефрадин и цефалоглицин. Применяют антибиотик и известные fl-лактамовые соединения в соотношениях от 20:1 до 1:150, предпочтительно, от 10:1 до 1:100. При лечении бактериальных инфекций у млекопитающих количество антибиотика его тритилового сложного эфира можно изменять в зависимости от объекта лечения, веса тела, типа, серьезности и симптомов инфекции, способа и количества введений. При обыкновенном оральном ИЛИ парентеральном введении целесообразной является суточная доза 0,05-500 мг/кг, предпочтительно 0,5-200 мг/кг, более предпочтительно в виде частичных доз. Дозы вне приведенного диапазона также могут быть применены в зависимости от индивидуальных условий подвергаемого лечению организма. Антибиотик или его тритиловый сложный эфир может найти применение не только в фармацевтических.составах, а также может быть добавлен в виде концентрата или же непосредственно в корм. Дополнительно его можно использовать в качестве активного ингредиента для консервирования кормов или их дезинфекции. Во всех примерах качественные и количественные опыты на противомикробное действие основаны на следующей методике. Биоиспытание на противомикробное дей зтвие. Полученную за ночь культуру Comainonas terrigena В-996 на косом питательном агаре взвешивают в питательном бульоне с целью достижения оптической плотности клеток порядка 0,040 при 610 нм. Пссевную взвесь добавляют в количестве 1% в расплавленную агаровую среду, содержащую 0,8% питательного бульонного порошка (Kyokuto Nutrient Broth Powder) и 1% Bacto-Agar. 7 мл засеянной расплавленной агаровой среды распределяют в чашке Петри диаметром 9 см и дают отвердеть. По лучают пастину типа Comamonas. Организм StaphyEococcus aureus FDA 209 Р культивируют за ночь в пи тательном бульоне со встряхиванием, разбавляя 50 раз питательным бульоном для получения посевной взвеси, 1% по объему этой взвеси тщательно смешивают с расплавленной агаровой средой, содержащей 1% Kyokuto Nutrie Broth Powder и 1% Bacto-Agar. 7 мл каждой из засеянной расплавленной агаровой среды вливают с гелеобразо ванием в. чашку Петри диаметром 9 см. Э.ту пластину обозначают биопластиной типа StaphyEococcus. Аналогично получают биопластину типа ACcaligenes. Полученную за ночь питательную культуру на косом агаре организма AEca igenes faecaCis В-326 взвешивают в питательном бульоне, получая суспензию из семян, концентрацию клеток которой доводят до оптической плотности 0,020 при 610 нм. Агаровую среду, состоящую из 0,5% Kyokuto Nutrient Broth Powder и 1% Bacto-Agar, расплавляют при допустимой температуре и засевают 1,0% прививочного материала посевной суспензии. 7 мл засеянной расплавленной аг ровой среды распределяют в чашке Пет ри диаметром 9 см и дают образоваться гелю. Эту пластину назьшают биопластиной типа AEcaEigenes. Пульповый кружок (8 мм) -обычным способом пропитывают раствором испытуемого образца, выдерживают на чистом листе фильтровальной бумаги в течение времени, достаточного для удаления избыточного раствора и затем переносят на биоиспытательную пластину. После инкубации при 35°С в течение 20 ч замеряют диаметр обра зовавшейся зоны ингибирования и срав нивают со стандартными растворами це :фалоридина. Антимикробное действие антибиотика и-родственных соединений выражают в виде единиц цефалоридинового эквивалента на мл. В частности, раствор антибиотика и родственных соединений согласно изобретению, показывающий тот же диа метр зоны ингибирования, как 100 мг/ дефалоридина, выражают, как 100 цефа .лоридиновых единиц/мл. Аналогично, е ли твердый образец антибиотика и род ственных соединений согласно изобретению дает при концентрации 1 мг/мл тот же диаметр, как 1 мг/мл цефалори дина, специфическая активность тверд го образца будет выражена, как 1 Цефалоридиновая единица на мг. Стандарт ная- кривая биологического опыта немн |го изменяется в зависимости от рода испытуемого организма. Для обозначен подопытных микроорганизмов применянгт следующие названия - сокращения: Comamonas цефалоридиновая единица JCCV) , Staphygococcus - це.фалоридиновая единица (SCV); AEcaEigenes - цефалоридиновая единица (ACV). Биоавтография. Изготавливают большую биоиспытательнуюпластину за исключением того, что 100 мл засеянной расплавленной агаровой среды вливают в прямоугольн то чашку 32 х 24 см, а не в чашку Петри (9 см). Подлежащую биоиспытанию бумажную хроматограмму помещают на 15 мин на эту большую испытательную пластину. По удалении бумаги испытательную пластину инкубируют 20 ч при З5с в целях обнаружения зон ингибирования. Эта техника позволяет не только вычитывать значение (я) Rf (качественное испытание), то также и определить ан.тимикробное действие, основываясь на размерах зоны-ингибирования. В случае применения пластины для тонкослойной хроматографии между ней ii поверхностью испытательной пластины помещают тонкую бумагу. Аналогичный способ применяют для качественного и полуколичественного биологических испытаний. Пример 1. Колбу Эрленмайера емкостью 500 мл, содержащую посевную культуральную среду, стерилизуют при 120с в течение 15 мин. К богатой спорами косой культуре организма Streptoravces А 271 добавляют 10 мл 0,02% iween-SO, после чего смесь слегка перемешивают, получая суспензию спор. Колбу Эрленмайера емкостью 500 мл инокулируют 1 iJm споровой суспензии, встряхивая затем в целях культивирования 48 ч при 28С на ротационном вибраторе. Затем 2 мл посевной культуры инокулируют в каждую из 6 колб Эрленмайера, из которых каждая содержит 100 М.П описанной среды, после чего 48- 96 ч культивируют, встряхивая при на ротационном вибраторе. Среда посевной культуры, вес.% Мясной экстракт 0,3 Bacto-tryptone0,5 Глюкоза0,1 Крахмал растворимый 2,4 Дрожжевой экстракт 0-, 5 Карбонат кальция 0,4 Обезжиренная соевая мука0,5 рН перед стерилизацией 7,5; после стерилизации 7,1; через 2 дня ферментации - 7,4. Производственная среда, вес.% Среда AG-1 Глюкоза1 / 5 . Крахмал кукурузный 2,5 Жидкость от. замочки кукурузы 2,0 Сухие дрожжи1,0 Метионин 0,1 0,00013 сосе2- рН перед стерилизацией 7,2; после сте1рилйзации - 6,1; через 4 дня фермента|ции - 7,8. Продолжение табл. Элюаты №№ 8-14 соединяют, концен рируют до 100 мл при температуре ни же 30°С на ротационном выпарном аппа рате и затем сушат замораживанием с получением 2,6 г желтовато-коричнево го порошка. Этот порошок растворяют в дистиллированной воде с концентра цией 500 ecu/мл. Растворы на основе фосфатного буфера заданных рн получают доведением 15 М дикалийфосфата до необходимого значения с помощью 5 и. гидроокиси натрия или 5 н. фосфорной кислоты. В 1 мл раствора антибиотика добавляют 1 .мл фосфатного буфера и значение рН доводят до первоначального. Растворы антибиотика с изменением рН выдерживают 30 мин при в водяной бане, охлаждают под проточной водой и нейтрализуют до рН 7,0 небольшим, количеством 5 н. гидроокиси натрия или 5 н. фосфорной кислоты. Контроль ,ную трубку, соде зжащую раствор антибиотика PS-5 с рН 7,0 помещсшт на ледяную баню на полчаса. Остаточную антимикробную активность замеряют описанным способом с применением в качестве подопытного микроорганизма Comamonas terrigena В-996. Остаточная активность, % Эти результаты показывают, что по лученный в настоящем примере желтова токоричневый порошок заметно стабилен при рЫ диапазона 6,9-9,0 в течение 30 мин при 60°С.Устойчивость айтибиотика повышается при болеенизких температурах даже при кислом рН. Так, например, после обработки антибиотика при рН 3,0 в течение 5 мин при -17С по меньшей мере 30% первоначального антибиотического действия еще можно установить. Пример 3., Экстракция при низкой температуре и -бутанолом. Большую исп : 1тательн ю трубку, содержащую 20 мл дистиллированной воды, 12 мл н-бутанола и 7 г хлористого натрия, охлаждают до -17с без замораживания. Желтовато-коричневый порошок антибиотика полученный в примере 2, разбавляют до концентрации 200 мг/мл в дистиллированной воде и предварительно замораживают, 1 мл холодного раствора антибиотика добавляют в эту испытательную трубку, быстро доводят рН до 2,75, 3,0 или 3,25 с помощью серной кислоты и выдерживая температуру смеси ниже - Ю-С. После тщательного перемеш1шания регенерируют н -бутаноловый слой и тщательно смешивают с 5 мл 0,5 М (рН 6,8), перенося активный компонент в водный слой. ; Пример 4. Получение порошка , аналохично примеру 2 из 100 л бульонного фильтрата после сушки замораживанием получают 27,7 г желтовато-коричневого порошка антибиотика. Этот порошок (активность 13,2 CCU/мг) растворяют в 30 мл 25 М фосфатного буфера (рН 6,8) и помещают на колонну из QAE-Sephadex А-25 основная анионнообменная смола, полностью переведен:ная в четвертичное соединение, полученная вводом диэтил-2-оксипропиламмониевых групп в декстрановый гель (3,3 X 25,0 см). После промывки небольшим количеством того же фосфатного буфера активную фракцию элюируют тем ке буфером, содержащим хлористый натрий в концентрации 0,5 М в ходе элюирования. Активную фракцию (300 мл) охлаждают до 0°С и обрабатывают б г активного угля. Активный уголь собирают, промывают водой к элюируют 50% по объему ацетона. По удалении ,ацетона выпаркой при температуре ниже 30°С 727 мг коричневато-желтого пороапса натриевой соли антибиотика регенерируют лиофилизацией. Удельная активность препарата - 264 ССи/мг. Пример 5. Получение порошковой дэаэ-целлюлозы. 727 г полученного в примере 4, коричневато-желтого порошка антибиотика растворяют в 1 мл 25 М фосфатного буфера (рН 6,8) к загружают на колонну (1,5 X 27,0 см из BiO-Gee Р-2 (поперечно сшитый синтетический сополиерный состав в виде катализирующего слоя на основе метилен.-бис-акриламид него сополимера, уравновешенного тем же фосфатным буфером. Проявляя тем же самым фосфатным буфером, получают активную фракцию в количестве 15 мл. Полученную активную фракцию помещают на колонну (2,5 х 28,0 см) из диэтиленминоэтиловой (ДЭАЭ) целлюлозы DE 32, уравновешенной тем же самым фосфатным буфером. Элюирование осуществляют линейным градиентом хлористого натрия в том же фосфатном буфере (0-0,5 М). Полученную активную фракцию (240 мл) адсорбируют на 4,5 г активного угля, при . Активный уголь с:обирают фильтрацией, промывают водо и элюируют 50% по объему ацетона. Аце тонный элюат выпаривают при температуре ниже до полного удаленияац тона, лиофилизируя затем с получением 120 мг коричневато-белого порошка натриевой соли антибиотика PS-5. Удельная активность этого препарата состав ляет 60.0 ССи/мг. Пример 6. Высокоочищенный препарат антибиотика. Аналогично примеру 1 организм Streptomyces А 271 культивируют в колбе Эрленмайера емкостью 500 мл, содержащей 100 мл среды SE-4 инокулируя затем в 30-литровый ферментатор, содержащий 15 л среды SE-4. Куль тивирование продолжают 24 ч при28°с и 200 об/мин с принудительной аэрацией в объеме 7,5 л/мин, получая культуру семян. 2 емкости для ферментации емкостью в 200 л, выполненные из нержавеющей стали, наполняют каждый 200 л среды ML-19, содержащей 2,5% обезжиренной соевой муки, затем обрабатывают в ав токлаве, инокулируют 1 л посевной культуры микроорганизма Streptomyces и 271, полученной описанным способом и ферментируют 12 ч с аэрацией и пере мешиванием. Содержимое обоих сосудов соединя ОТ, смешивают с 5% по весу Торср Pertite, Торсо N 34 (Торсо Pereite Kogyo К.К.) и фильтруют через фильтр-пресс, получая 160 л буль онного фильтрата. Антибиотичный титр этого фильтрата оказывается равным 235 ССи/мл. Этот бульонный фильтрат пропускают через колонну из ионообме ной смолыDIAION РА-306 (сильно осно ная днионноабменная -смола, с поперечн сшитой полистироловой матрицей и; три метиламмонийхлоридными звеньями) 10 X 52 см, 4,5 мл влажного объема без остатка. Затем активный продукт, про пущенный через эту колонну, адсорбир ют -на колонне из DIAION НР-20 (14 х X 97 см; 15 л) и элюируют 75% метано ла. Собранный активный элюат (2 л, 9,854 ССи/мл) трижды разбавляют 4 л поды и загружают на 2-литровую колон ну (5,5 X 84 см) иэ DIAION PA-306S. После промывки 500 мл воды антибиоти ческий материал элюнруют 8 л линейного натрийхлоридного градиента 0-3% и собирают по фракциям в 200 мл. Активные фракции №№ 17-31 собирают, поучая 2,8 л активного элюата (4,120 си/мл). Этот элюат снова загружают на 1-литровую колонну из DIAION НР-20 (4,5 X 63 см) и элюируют 3-литровым линейным градиентом ацетона от О до 25%. Объем каждой фракции составляет 30 мл. Активный элюат (390 мл 27,220 оси/мл) выделяют, соединяя антимикробно активные фракции №№ 54-66. По удалении ацетона перегонкой под пониженным давлением элюат DIAIOl НР-20 пропускают через колонну емкостью 200 мл из QAE-Sephadex А-25 (2,5 X 41 см). Антимикробное активное вещество собирают по фракциям в 10 мл путем элюирования 2-литровым линейным натрийхлоридным градиентом (0-1,5%). Фракции №№ 68-81 соединяют в качестве активного элюата (140 мл; 42, 120 ССи/мл). рН этого элюата QAE-Sephadex А-25 осторожно доводят до 8,3 с применением 1%-ной гидроокиси натрия и загружают на колонну из 200 мл DIAION HP-20AG (2,5 X 41 см). Элюирование линейным градиентом осуществляют с применением 1 л водного ацетона от О до 10%-ного, Объем каждой фракции составляет 10 мл. Фракции №№ 48-53 соединяют, получая 60 мл активного элюата (45,000 CCU/мл). Сушкой замораживают, получая 249 мг желтого порошка (8,000 ССи/мг). : В целях дальнейшей очистки 150 мг этого желтого порошка растворяют в небольшом количестве 0,01 М натрийсульфатного буфера (рН 8,0),,пропуская через колонну (130 мл; 1,5 х X 73 см) из Sephadex G-10 (декстрановый гель в виде катализирующего слоя, получаемый сшиванием декстрановых фракций эпирхлоргидраном) . Антибиотик проявляют 0,01 М натрийфосфатным буфером (рН 8,0-), фракцинируя элюат, 36 мл активного элюата получают из фракций №№ 38-55 (65,000 ССи/мл). Элюат Sephadex G-10 хроматографируют на колонне из QAE-Sephadex А-25 (100 мл; 2,0 X 32 см) с последующим элюированием с применением линейног.о градиента посредством 1 л раствора хлористого натрия от О до 1,5%-ного. Объем фракций - 10 мл. В качестве активного элюата собирают 5 активных фракций №№ 48-52 (50 мл; 22,000 ССи/мл). рН этого активного элюата осторожно доводят до 8,3 посредством 1%-ной гидроокиси натрия и загружагот на колонну из 50 мл DIAION НР-20. (1,2 х X 44 см) . Натриевую соль антибиотика выдел ют из фракций 5 мл элюированием лин ным градиентом посредством 400 мл водного ацетона от О до 10%-ного. Активные фракции №№ 39-41 собирают лиофилизируют, получая 51 мл белого порошка (21,000 CCU/мг). Такой препарат на основе натриево соли антибиотика представляет вещест во белого цвета, растворимое в водр и нерастворимое в ацетоне. При замере в аппарате для измерения микроточки плавления Кофлера ВУ- при повышении температуры со скоростью l C/MHH этот препарат не показывает ясной точки плавления. Он ста новится желтым около 148С и постепе но размягчается вы1яе 1бО°С. Около 203С оттенок препарата медленно пер ходит из желтого в коричневый цвет. При 220°С - коричневая смола. УФ-спектр поглощения. 60 мкг натриевой соли антибиотика растворяют в 3,0 мл воды, замеряя в спектрофотометре. Замеренные результаты/ полученные расчетным путем следующие са .246 nm ( 82,0 301 nm (11° 267,5). в водный раствор этого препарата (21,000 ССи/мг) в дистиллированной воде добавляют гидроксиламйновый раствор (рН 7,5) для получения реакционной смеси, содержащей 21,3 мкг/мл натриевой соли антибиотика и 10 мМ гидроксиламина. Через полчаса при 22°С реакционная смесь теряет около 94% первоначальной оптической плотности при 301 нм. ИК-спектр поглощения. Характерные максимумы поглощения наблюдаются при указанных длинах волн; около 1750 см (-СО- в р-лакта мовом кольце) ; около 1650 см- (-СО- Б агишдной связи) ; около 1640 - 1540 см- (-COCf) . ПМР-спектр. НижеприведенньЕ харак терные сигналы получены в виде измерения: триплет с центром около 1,06 .частей/миллион (J -около 7,5 Гц) (CH -CHg-); мультиплет в области 1,7 2,00 частей/миллион ); резкий сйнглет около 2,65 частей/мйлЛИОН (); мультиплеты в области 2,88-3,58 ч/м (-СН-, -СН-); мультиплет в области 3,9-А, 20 ч/м (-СН-) Цветовая реакция. Реактив Эрлиха положительная реакция Йодоплатинат То же Нингидрин Отрицательная реакция. Удельное вращение. -Тц- + 1,23 (с 1,59, 0,01 М, рН 8) трийфосфатный буфер. Тонкослойная хроматографиа (ТСХ). Натриевую соль антибиотика подверют тонкослойной хроматографии в уканных условиях. Значения Rf опредеют биоавтографией. Целлюлозная ТСХ-пластина. Система растворителей R(f) н-Бутанол(этанол)вода -7/7/6/по объему . 0,94 Изопропанол/вода -7/3 по объему0,96 Силикагельная ТСХ-пластина предвательно покрытая Силикагельная пласна 60 F.-,. ) . Система растворителей Этанол/вода - 7/3 по объему н-Пропанол/вода - 7/3 по объему ажная хроматография. Натриевая соль антибиотика дает дующие значения R(f) на фильтруюбумаге Тоуо Fitter Paper N 50 , казанных условиях Система растворителей н-Пропанол/вода -7/3 по объему0,68 н-Прогтанол/изопропанол/вода - 7/7/6 по объему 0,70 Ацетонитрил/вода - 8/2 по объему 0,36 Ацетонитрил/трис-буфер/ ЭДТА0,34 (Смесь растворителей, состоящая из 120 мл ацетонитрила, 30 мл буфера на основе М/10 трис(оксиметил)аминометанхлористоводородной кислоты рН 7,5 и 1 мл М/10 этилендиаминтетраацетата рН 7,5) Этанол-вода - 7/3 по объему . 0,63 Высоковольтный бумажный электро- ез. Натриевую соль антибиотика аналиуют высоковольтным бумажным электорезом в указанных условиях. Фильтровальная бумага для анали- Тоуо Fitter Paper N 50. Полученные результаты следующие: проведении электрофореза в тече30 мин с охлаждением ниже f С потенциале 42 В/см в буфере (рН ), содержащем 3,3 г барбиталя и 5 г мединала в 3000 мл воды, антитик мигрирует к аноду (28 мм). - Магнитный резонансный спектр Применяя в качестве внутреннего ндарта диоксан С -магнитный резосный спектр натриевой соли антибика в тяжелой воде замеряют с помоспектрометра. Получают следующие актерные сигналы: (1)184,04 ррт (2) 174,96

169,29 141,11 130,40

(диоксан) 67,39 60,19 55,63 40,41 40,00 31,49 22,62 22,46 11,36

Антимикробный спектр действия. Значения минимальной ингибирующей концентрации (МИК) натриевой соли антибиотика определяют на различных патоген- 4нын -микроорганизмах, включая устойчивые штаммы, методом разбавленного бульона,

Натриевую соль антибиотика растворяют в бульоне Brain Heart infusion Broth .Eiken (pH 7,0) при концен- 20 трации порядка 5-50 мкг/мл, из кото- рого изготавливают ряд разбавленных продуктов в той же жидкой среде. Микроорганизмы культивируют 18 ч в буль-. Примечание:

оне Brain Heart jnfiision Broth EiKen при 28 С при окончательном размере прививочного материала 1x10 клеток/мл Культуре дают стоять 20 ч при , после чего регистрируют рост микроорганизма каждого образца разбавленного антибиотика. МИК показывает минимальную концентрацию антибиотика (натриевой соли его), где визуально нельзя определить размножения основного микроорганизма. В качестве контроля 2 известных Ъ -лактамовых антибиотика - цефалоридин и цефокситин растворяют в бульоне brain heart infusion broth (рН 7,0) при концентрациях порядка 1-100 мкг/мл и затем разбавляют в целях получения ряда разбавленных культур в приведенной жидкой среде. Эти образцы обрабатывают способом, описанным для определе ния МИК.

В табл. 4 приведены полученные результаты(дополнительно к значениям МИК антибиотика для сравнения включены данные для цефалоридина и цефокситина).

Таблица 4 + образующийр-лактамазу организм; 2+ устойчив к анамицину/ гентамицину и тобрамицину; 3 устойчив к гентамицину и тобрамицину, 4+ - в среде добавлено 10% лошадиной крови.

Усилие антимикробного действия известных (Ь -лактамовых соединений против микроорганизмов, устойчивых к /i-лактаму.

10 мл расплавленного питательного агара, содержащего 50 мкг/мл пенициллина G или цефалоридина, 0,8% бульонного порошка Kyoto Nutrient Broth Powder и 1,0% агара Difco Bacto-Agar (pH 7,0) засевают микроорганизмами, устойчивыми к {Ь-лактаму и образующими (5-лактамазу, выливая затем в чаш;ку Петри (9 см) в целях получения биоиспытательной агаровой пластины.

Устойчивый кр -лактаму

На эту агаровую пластину помещают пульповые кружки (8 мм), содержащие ,каждый 25 мкл растворов антибиотика PS-5 в заданной концентрации, после чего инкубируют при в течение 18 ч перед регистрацией зон ингибирования. Контрольную испытательную пластину изготавляют аналогично, но без пенициллина G или цефалоридина. ,В контроле на пластинах испытывают :В тех же условиях пенициллин G, ам:пициллин, оксациллин и цефазолин.

В табл. 5 и 6 приведены полученные результаты.

Таблиц-а 5

27

73851728

Наблюдается сильное ингибирование пенициллиназы микроорганизма Proteus vuCgaris за счет действия антибиотика. При наличии 1/42 эквивалента антибиотика в пенициллине G в качестэе субстрата более 50% активности

Таблица 6

Proteus Р-5-р1-лактамазы ингибируется.

Пример 7. Способ получения (препарата тритилового сложного эфира 65 Антибиотика. 30,0 г желтовато-коричневого лио филизированного порошка натриевой со ли антибиотика (удельной активности 27 ССи/мг) растворяют в 100 мл диметилформамида с добавлением 3,0 г три тиламина, Охлажцая льдом, в реакцио ную смесь добавляют 9,0 г тритилхлорида с вьщерживанием температуры раствора ниже . После перемешивания в течение 12 ч при 5°С весь активный материал антибиотика превращается в продукт тритилирования. .Реакционный раствор выливают в 1000 мл 0,5 М фосфатного буфера (рН 6,8), экстрагируя затем трижды 1000 мл этилацета та в каждом случае. Этилацетатные экстракты соединяют, дегидратируют безводным сульфатом натрия и выпарив ют досуха при по,ниженном давлении. Остаток от выпарки растворяют в 20 м бензола и пропускают через колонну из Bio-Beads S - ХЗ (пористый слой стиролдивинилбензольного сополимера для гельпермеации; 4,5 х 60,0 см), /которую предварительно уравновешиваю бензолом. Колонну проявляют бензолом Активная фракция, показывающая антибиотичное действие на испытательной пластине Comamonas, концентрируется досуха при пониженном давлении. Полученный остаток растворяют в 1 мл бензола и загружают на силикагелевую колонну (25 г; 1,5 х 24,0 см). После промывки бензолэтилацетатной ..смесью (10:1) в целях удаления остаточных реактивов, активный материал элюируют бензолэтилацетатной смесью (1:2). Активный элюат выпаривают досуха под пониженным давлением и снова растворяют в 0,5 мл бензола. Бензольный раствор помещают на нейтральную колонну из окиси алюминия и проявляют бенэолэтилацетатной смесью при различных соотношениях (10:1, 6:1, 4:1, 3:1, 2:1 и 1:1). Активные элюаты соединяют и выпаривают досуха при пониженном давлении. Остаток от выпарки растворяют в 0,3 мл бензола, загружают На силикагелевую колонну (10 г,, 0,9 х 22,0 с По удалении примесей с помоЩью бензо этилацетатной смеси (10:1) активный материал элюируют бензолэтилацетатно смесью (1:2) и концентрируют под пониженным давлением с получением твер дого порошка. Полученный порошок растворяют в 0,5 мл бензола и очищают на колонне Bio-Beads S - ХЗ. (1,2 х 96 см) с применением бензола в качестве агента проявления. Активный элю ат выпаривают досуха в вакууме. Полу ченный сухой порошок растворяют в 0,5 мл ацетона и подвергают гель-. .фильтрации с применением колонны Sephadex LH-20, декстрановый гель в виде слоя, получаемый поперечным сши ванием декстрановых цепей оксипропилированием (1,2 х 96,0 см), которую предварительно наполняют ацетоном до взбухаиия. Активную фракцию выпаривают досуха, получая 23 мг белого порошка. Перекристаллизацией этого порошка из бензолгексановой смеси получают 12 мг бесцветного кристаллического порошка-продукта (10,800 ССи/мл). Бесцветный кристаллический продукт является тритиловым сложным эфиром антибиотика. Растворимость продукта тритилирования антибиотика определяют растворением со встряхиванием 5 мг в каждом случае продукта тритилирования антибиотика PS-5 в 0,1 мл каждого из испытуемых растворителей при 20с. Результаты следующие: в основном не растворяется в воде, И-гексане и петролейном эфире (т. кип. ЗО-бО С). Высокорастворим в бензоле, этилацетате, хлороформе, метаноле., этаноле, ацетоне, диметилформамнде (ДМФ) и диметилсульфоксиде (ДМСО). Устойчивость. Тритиловый сложный эфир антибиотика растворяют в 1 единице по объему метанола, разбавляя затем 9 единицами по объему дистиллированной воды, как только оказывается возможным получить раствор 125 ССи/мл 10 М раствор дикалийфосфата обрабатывают 5 н. фосфорной кислотой или 5 н. гидроокисью натрия до достижения рН 3-9. К 1 1ЧЛ каждого из фосфатных буферов добавляют 1 мл каждого из упомя нутых растворов тритилового сложного эфира антибиотика; в соответствующем случае рН смеси подрегулировывают до требуемого значения с применением фосфорной кислоты или гидроокисью натрия. Раст-вор смеси вьдерживают в водяной .бане 30 мин при , охлаждают проточной водой и нейтрализуют до рН 7,0 небольшим количеством фосфорной кислоты или гидроокиси натрия. Контрольный раствор (рН 7,0) выдерживают на ледяной бане на протяжении всего опыта. Остаточный антибиотичный материал испытывают обьгчным биоиспытательным методом с применением в качестве подопытного микроорганизма Comaraonas terrigena В-996. Продукт тритилирования антибиотика плавится при 83,5-85,, постепенно становясь коричневым при температуре выше 140°С. УФ-спектр поглощения продукта тритилнрования антибиотика согласно изобетению регистрируют с помощью спектофотометра при концентрации 128 мкг/3 мл метанола. С° 315,5 (Е 156) Характерные максимумы поглощения наблкщаются при следующих диапазонах волн: 3430, 3100-3000 (С-Н фенильной группы) ; 2990,2950,1770 (С-О р-лактамового кольца) ; 1695 (-СО-амидной связиГ 1665 (--СО-0, сложноэфирной связи) ; 1445, 1340, 1275, ИЗО спГ. , ПМР-спектр. Самые характерные сиг налы следующие: триплет около 1,10 ч (3 - около 7,0 Гц); синглет при 1,86 ч/м; мультиплет в области 7,107 56 ч/м (протоны в бензольном кольце тритиловой группы). . Элементарный анализ. 3,5 Ml продукта тритилирования ан тибиотика сушат .при комнатной температуре „. ч при пониженном давлении 1 X 10 мм рт.ст. и подвергают элемен тарному анализу. Найдено, С 61,89%; Н 5,78%; N 4,48%; S 4,62%. Цветовая реакция. Реактив Эрлиха Положительно ТрифенилтетразолийОтрицательноXлорид Отрицательно Хлорид железа Хлористое железоОтрицательнойод Йэдплатинат Положительно Гид рокеиламинПоложительнохлористое железо Хлортолидин Положительно Отрицательно Нингидрин Тонкослойная хроматография (ТСХ) Трити/ овый сложный эфир антибиоти ка дает следу1ощие- значения R в зада ных условиях. Сторону миграции опред ляют биоавтографией на Comamonas ter rigena В-996. Силикагельная ТСХ: пластина,предв рительно покрытая, силикагельная 60 Р 54Система растворителей: бензол/ацетон (2:1) R : 0,29. Цэллюлозная ТСХ: пластина Eastman Chromagran Sheet 13254 Ce&EuE-ose с флуоресцентным реактивом., (NO 6065) . РастворительR(f) Верхняя фаза,и-бутанол/ /этанол воды (4:1:5)0,56 м-Бутанол,1,0

StaphyEOCOCCUS aureus FDA 209 р StaphyKococcus aureus Smith Dip ococcus pneumoniae Type III Streptococcus pyogenes NY-5 Sacrina Eutea S-19 Escherichia co2i К 12

0,04 0,04 0,01 0,01 0,05 2,5 Изопропанол/вода (8:7) 0,91 Изопропанол/вода (1:4) 1,0 Молекулярная структура антибиотика и приведенные физико-химические свойства подтверждают структурную фо. мулу тритилового сложного эфира антибиотика. Биологические свойства тритиловогс.. сложного эфира. Антимикробный спектр действия. Значения МИК соединения определяют на различных патогенных микроорганизмах, включая определенные устойчивые штаммы, с применением метода разбавле. ния бульона. В частности тритиловый сложный эфир антибиотика растворяют в небольшом количестве метанола и разбавляют, как только становится возможным в бульоне Brain Heart Dnfusion Broth Eiken до концентрации тритилового сложного эфира антибиотика порядка 40-20 мкг/мл. Ко.нцентрация метанола в целевом растворе не превышает 10%. Этот раствор разбавляют согласно двукратному геометрическому ряду.. Микроорганизмы, приведенные в табл,.. 7, культивируют 18 ч при 28°С в бульоне и инокулируют с получением серий разбавленного продукта с окон 1ательным размером прививочного материала 1 X 10 клеток/мл. Результаты регистрируют после инкубации при в течение 20 ч. Значения МИК показывают низшую единицу концентрации продукта тритилорования антибиотика, когда не наблюдается роста соответствующих микроорганизмов в описанных условийх. В качестве контрольных антибиотиков изготавливают растворы ампициллина и .цефалоридина при концентрации 100 мкг/мл с обработкой, аналогичной обработке соединения согласно изобретению. В табл. 7 сведены значения МИК тритилового сложного эфира антибиотика вместе с таковыми ампициллина и цефалоридина в качестве контроля. Таблица 7 Как видно из таблицы, тритиловый сложный эфир антибиотика оказывает широкое антимикробное действие, в ча стности сильное антибиотичноё деиствие на различные штаммы микроорганиз мов, устойчивых к р-лактаму {образую щих fb-лактамазу) . УСИЛЕНИЕ ДЕЙСТВИЯ ТРИТИЛОВОГО СЛО НОГО ЭФИРА АНТИБИОТИКА НА АНТИБИОТИЧЕСКОЕ ДЕЙСТВИЕ ПЕНИЦИЛЛИНОВЫХ И ЦЕФАЛОСПОРИНОВЫХ СОЕДИНЕНИЙ ПРОТИВ УСТОЙЧИВЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ Испытательные чашки Петри (диаметром 9 см), содержащие устойчивые микроорганизмы, получают нанесением 10 мл расплавленного питательного ргара с посевом микроорганизмов ус- гойчивых к р-лактаму (образующих |}-лактамазу) , на твердый основной слой питательного агара (рН 7,0 , 15 мл), .содержащего 50 мкг/мл пенициллина G или цефалоридина. ИспыjПродолжение табл. 7 туемые антибиотичные растворы помещают на пульповый кружок (8 мм) в крличестве 25 мкл и затем на испытательные пластины. После инкубации при . 35°С в течение 18 ч замеряют зс-ну ингибирования и сравнивают с результатами на соответствьтощнх пластинах, не содержащих ни пенициллина G, ни цефалоридина. в табл. 8 приведены результаты, Из данных табл. 8 совершенно ясно, что комбинация продукта тритилирования антибиотика в концентрации ниже нижнего предела биологического опыта с пластинами с пенициллином G или дефалоридином в концентрации ниже этого предела дает значительную зону ингибирования. Этот факт ясно подтверждает усиление антибиотического действия пенициллина G или цефалори(Цина продуктом тритилиррвания антибиотика. Подтверждение антимикробного синер гизма продукта тритилирования антибиотика и цефалоридина путем метода разбавления бульона на штамме Proteus vufigaris, устойчивом против | -лактам Штамм Proteus vuEgaris Р-5, устойчивый к р -лактамовым соединениям за -счет образования р)-лактамазы, поэт му применяют сочетание 7,5% МИК цефалоридина с 12,5% МИК тритилового слож ного эфира антибиотика, что ингибируе рост подопытного микроорганизма. Активность на живом организме продукта тритилирования антибиотика замеряют на мьошах, инфицированных внутрибрюшинно организмом StaphyEococcu aureus Smith в количестве 5 х 10 кле ток на мышь. Тритиловый сложный эфир антибиотика вводят подкожно непосредственно после заражения. 50%-ная лечебная доза у мышей-самцов составляет 2,55 мг/кг (27.540 CCU/кг). Ингибирующее р-лактамазу действие 50% гидролизата цефалоридина ингибируется посредством 0,60 и 0,80 мкг/мг продукта тритилирования антибиотика PS-5 в ходе опыта (-лактамазой Proteus vuEgaris Р-5 и Citrobacter freundii Е-9, соответственно. Токсичность. Тритиловый сложный эфир антибиотика PS-5 не вызывает смертельного действия у мышей-самцов при внутрибрюшном введении в количестве 500 мг/кг. Пример 8. Способ получения продукта тритилирования .антибиотика Коричневато-желтый порошок натриевой соли антибиотика PS-5 (715 мг, 235 ССи/мг), полученный аналогично примеру 4, растворяют в 3,5 мл гексаметилфосфортриамида. По добавлешик 70 мг триэтиламина с охлаждением льдом, в смесь добавляют 250 мг триi a б л и 1.1; a тилбромида при температуре ниже 10°С. Смесь перемешивают при в течение 7 ч в целях завершения реакции тритилирования. Реакционную смесь выливают в 50 мл ледяной воды и вьщерживанзт до расплавления твердого льда. Тритиловый сложный эфир антибиотика трижды экстрагируют с применением 15 мл бензола (каждый раз) и обрабатывают аналогично примеру 7, получая 9,4 мг бесцветного кристаллического порошка. Физико-химические свойства этого препарата аналогичны примеру 7. Пример 9. Получение продукта тритилирования антибиотика в присутствии CROWN-эфира. Сырой коричневато-белый порошок (10,1 г) лиофилизации, полученный аналогично примеру 2, взвешивают в 20-0 мл хлористого метилена и растворяют с перемешиванием и добавлением 1 мл 15 - Crown - 5. Вьвдерживая температуру раствора ниже 5С с помощью льда, добавляют 8,5 г тритилхлорида. Реакционную смесь нагревают до комнатной температуры и перемешивают 3 ч. После фильтрации фильтрат выпаривают досуха при пониженном давлении. Остаток растворяют в. 10 мл бензола за один прием, фильтруют и очищают аналогично примеру 7, получая 7,3 мг бесцветного кристаллического порошка. Пример 10. Способ получения продукта тритилиров.ания антибиотика в присутствии четвертичной аммониевой соли. Антибиотик экстрагируют из 48 л бульонного фильтрата (11,7 CCU/мл) два раза с применением 15 л в каждом случае дихлорметана, содержащего . ,0,05% цетилдиметилбензиламмонийхлорира (активность дихлорметановогр экстракта 24,0 CCU/м-п; активность исполь зуемого бульонного фильтрата.- 5,7 ССи/мл). Дихлорметановый экстра сушат 4UU г безводного сульфата натрия и выпаривают до 500 мл под по ниженным давлением на ротационном выпарном аппарате. Концентрат (450 ССи/мл) дегидратируют вначале 10 г безводного сульфата натрия, а затем по фильтрации - 5 г молекуля,рного сита 4 А, В этот сухой раствор добавляют 4,5 г тритилхлорида при температуре ниже 5с, перемешивая смесь 5 ч при 5с. По удалении дихлорметана выпаркой при комнатной температуре, остато растворяют в 15 мл бензола и очищают аналогично примеру 7, получая 8 мг безводного кристаллического порошка тритилового сложного эфира антибиоти ка. Физ.ико-химические свойства этого препарата почти идентичны с таковыми примера 7. Пример 11. Метиловый сложны эфир антибиотика. 90 мг натриевой соли антибиотика, полученной аналогично примеру 6 (8,000 ССи/мг), взвешивают в 3 мл су хого диметилформамида, добавляя зате 50 мг триэтиламина и 0,3 мл йодистог метила. После перемешивания в течени 2,5 ч при комнатной температуре добавляют 100 мл бензола, тщательно пе ремешивая для экстрагирования. Бензо ный слой отделяют, промывают 100 мл 0,1 М (рН 6,8) и затем сушат безводн сульфатом натрия. Сухой бензольный р створ концентрируют до небольшого об ема под пониженным давлением и загру жают на колонну (1,2 х 90 см) из Bio-Beads S-ХЗ. Метиловый сложный эфир проявляют бензолом. Элюатные фракции содержащие сложный эфир, соединяют и выпаривают досуха под пониженным давлением, полу чая бесцветное масло. Маслянистый продукт растворяют в небольшом количестве ацетона и хроматографируют на колонне (1,2 X 90 см) Sephadex LH-20 ацетоном в качестве проявителя. Элюатные фракции, содержащие метиловый сложный эфир антибиотика, собирают и выпаривают досуха, получая 11,2 мг метилового сложного эфира антибиотика. Метиловый сложный эфир отличается следующими физическими и кимическими свойствами. . , . Тонкослойная хроматография. Rj 0,45 (силикагельная пластина 60 Р бензол : ацетон 1:1). УФ-спектр поглощения: максимум в метаноле CHjOH Л 315,5 nm max ИК-спектр поглощения: максимум в шороформе 3430, 1766, 1660 смСигналы в ПМР в дейтерийхлороформе (&) 1,05 (3 Н, t, 3 7,5 Hz); 1,7-2,0 (2Н, m) ; 2,00 (3 Н, S); 2,83,65 (7 Н, т); 3,83 (3 Н, S); 3,844,06 (1 Н, т) . Молекулярный вес (масс-спектрометрия высокой степени разрешения). Найде но: 312,1131. СН4Н S Вычислено; 312, 1143. На основе приведенных данных меTIiлoвый сложный эфир антибиотика действительно соответствует структурной формуле II, указанной выше, где R - метил. Прием, описанный в примере 2, повторяют с применением этилйодида, изопропилйодида, изобутилйодида, н-пентилйодида или н-гексилйодида вместо метилйодида, получая сложные эфиры антибиотика этиловый, изопропиловый, изобутиловый, Н-пентиловый, «-гексиловый сложный эфир,. Образование этих сложных эфиров, подтверждается тонкослойной хроматографией, ИК-спектрометрией поглощения, ПМР-спектрометрией и масс-спектрометрией. Составы, содержащие антибиотик и/или тритиловый, сложный эфир антибиотика, можно вводить в разных единичных дозах, как твердых или жидких, оральных формах для проглатывания. Эти составы содержат на единичную дозу, жидкую или твердую, активный маггериал в количествах от -0,1 до 99%, предпочтительно, 10-60%. Количество активного ингредиента в составе может колебаться в зависимости от вводимой формы и общего веса состава, причем обычно колеблется в пределах диапазона 10-1000 мг, предпочтительно, 100-1000 мг. В парентеральных составах единичная доза является обычно чистым или высокоочищенным антибиотиком, его фармацевтически совместимой.солью и/или продуктом его тритилирования в растворе в стерильной воде или же в виде раст.воримого порошка, предназначенного для растворения. Активный продукт может вводиться также и в сочетании с соединениями, чувствительными к З-лактамазе. Предлагаемый способ позволяет полуить новый антибиотик. Формула изобретения Способ пол чения антибиотика обей формулы tej-CHjS - CHj - CKj-NH- СО - CHj 0 где Rj, - водород, металл, ашкил или трифенилметил, з аключаю397385174ь

щ и и с я в том, .что штамм Strepto--неральные соли, при рН 4,0-9,0 и темmyces А 271 выращивают в аэробных ус-пературе 20-40 С с последующим выделеловиях в питательной среде, содержа-нием целевого продукта в виде кислощей источники углерода и азота и ми-ты или в виде сложного эфира или соли.