Способ очистки калликреина Советский патент 1975 года по МПК A61K35/39 A61K38/43 C07K1/18 B01D15/08 A61K38/16 

(54) СПОСОБ ОЧИСТКИ КАЛЛИКРЕИНА сом. Адсобрцию осуществляют при значении рН 4,8-8,0. Элюирование осуществляют повыщением концентрации соли при постоянном значении рН, или снижением значения рН при постоян ной концентрации соли, или комбинацией обоих способов. Изменение рН и концентрации соли осуществляют беспрерывно, как градиентное проявление, или постепенно. Применяют все известные буферные соли, но предпочитают летучие буферные соли, например формиат аммония, ацетат аммония, пропионат аммония или соответствующие соли алкиламмония, например формиат триэтиламмония. Адсорбируют калликреин из 0,2 М ацетата аммония со значением рН 5,0 на ДЕАЕ-сефадексе в виде колонны, неактивный протеин промывают 0,25 М ацетатом аммония со значением рН 5,0 и затем элюируют обогащенный калликреин 0,3 М ацетатом аммония со значением рН 4,5. Обогащенный таким образом калликреин подвергают дальнейп1ей очистке обработкой макропористыми катионитами. Получают препаоаты чистотой 90%. В качестве макропориЛ. --- стых катионитов применяют кислозамещенные целлюлозы или кислозамещенные гели, например, из декстранов с поперечными связями или полиакриламида, с достаточной величиной пор. Обработку раствора обогащенного калликреина катионитом осуществляют посредством размешивания его с катионитом или фильтрования через слои катионита. Во время размешивания или фильтрации удерживаются сопутствующие вещества гелей, в то время как калликреин беспрепятственно проходит через фильтрующий слой. Применяемые для фильтрации или перемешивания макропористые катиониты лодвергают предварительной обработке известными приемами. Для фильтрации их вмещивают в разбавленные буферные растворы и подают в виде суспензии, например, в колонны с большим диаметром. Для получения буферных растворов применяют известные буферные соли, но предпочитают летучие буферные соли, например формиат аммония, ацетат аммония, пропионат аммония, или соли алкиламмония, например формиат триэтиламмония. Значение рП буферных растворов выбирают между 4,5 и 8,5, Для получения кристаллического калликреина кристаллизуют калликреин высокой чистоты прибавлением сульфата аммония в твердом виде или в виде концентрированного раствора при значении рН 4,0-8,0. Кристаллизацию начинают при насыщении сульфатом аммония 45% по истечении нескольких дней при температуре 15-25°С. Кристаллы выделяют из маточного раствора центрифугированием или фильтрованием, промывают 50%-ным насыщенным раствором сзльфата аммония и растворяют в разбавленных солевых растворах или в воде. g Для получения кристаллических компонентов А и Б калликреина разделяют очищенный калликреин известными методами - хроматографией с ДЕЛЕ-сефадексом. Компоненты калликреина высокой частоты кристаллизуют отдельно прибавлением сульфата аммония в твердом виде или в виде концентрированного раствора при значении рН 4,0-8,0. Кристаллизацию начинают при насыщении сульфатом аммония по истечении нескольких дней при температуре 15-25°С. Кристаллы имеют форму игл, соединяющихся в пучки. Кристаллы выделяют из маточного раствора центрифугированием или фильтрованием, промывают50%-ным насыщенным растворомсуль,,, ,„„,- сгглп; 1,- -,, ..-фата аммония и растворяют в разбавленных солевых растворах или в воде. Кристаллы состоят из чистого, электрофоретически однородного калликреина А и Б. Раствор кристаллов калликреина и компонентов калликреина характеризуется УФспектром при значении рН 7 с максимумом при 282 нм, минимумом при 251 нм, с 2 плечами при 277 и 290 нм и соотнощением экстинкции при 280 и 260 нм 1,78. Кристаллический калликреин и кристаллические компоненты А и Б применяют в качестве эффективных составных частей лекарственных средств. Пример 1. 200 л полученного из поджелудочной железы свиней и подверженного диализу элюата осадка свинцовой соли, содержащего 10,8 млн. ед. калликреина, сгущают в тонкопленочном выпарном аппарате до 15 л и затем обессоливают гель-фильтрацией в колонне сефадекса Г-25. Значение рН обессоленного раствора устанавливают 5,0 и отфильтровывают образовавщийся при этом осадок. Затем прибавляют твердый ацетат аммония до удельной электропроводности 12 ms (микросименс). Этот раствор подают на колонну ДЕАЕ сефадекса А-50, уравновещенного с 0,2 М ацетатом аммония со значением рН 5,0, калликреин при этом адсорбируется. Затем элюируют колонну сперва л и 0,25 М ацетатом аммония со значением рН 5,0, а потом 0,3 М ацетатом аммония со значением рН 4, 5. Калликреин проявляется в элюате после того, как значение рН снижается до 4,5. Активные фракции содержат 9,35 млн. ед. калликреина (86,5%). Раствор концентрируют в вакууме и обессоливают в олонне сефадекса G-25. Лиофилизованная роба имеет специфическую активность 14 ед. калликреина/мг. Пример 2. Обессоленный раствор объеом 300 мл фильтруют в колонне СМ-сефаекса G-50, уравновешенного с 0,01 М ацетаом аммония со значением рП 5,0. В злюате оявляется калликреин, затем неактивные зарязнения. Фракция калликреина (930 мл) соержит 5,5 млн. ед. калликреина (59%). Лио,,- ...л. . I/IWOилизованная проба имеет специфическую ктивность 1060 ед. калликреина/мг 220 ед. калликреина/мг протеина. 56

Предмет изобретенияцелью повышения чистоты и выхода целевого

Способ очистки калликреина путем хрома-на макропористом катионите, например,

тографии частично очищенного препарата на СМ-сефадексе, с последующей кристаллизамакропористом анионите, например ДЕАЕ- 5 дией и разделением на активные компоненты целлюлозе, отличающийся тем, что, с при необходимости.

482934

продукта, проводят дополнительную очистку