Способ получения пенициллинацилазы Советский патент 1974 года по МПК C07G7/28 

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЕНИЦИЛЛИНАЦИЛАЗЫ

200 г бентонита, отделяют аналогичным образом и вымывают 5 л 1 М ацетата натрия ори рН 8,0. Элюат 51000 ед. (53%), специфическая активность 1,8 ед/мг обессоливают фильтрацией на геле и после хроматографирования на сефадексе SE получают раствор чистых энзимов, который концентрируют, смешивают с насыщенным раствором сульфата аммония и кристаллизуют пенициллинацилазу, как в примере 1.

Пример 3. Переведенный в растворимую форму сырой экстракт, полученный из 2900 л культуры Е. соИ, центрифугируют при рН 5,0, 256 л чистого раствора (150000 ед., специфическая активность 0,32 ед/мг) разбавляют водой до 920 л, добавляют 1 кг бентонита, размешивают 1 час, отделяют центрифугированием. Вымывают 0,5 М ацетатом натрия при рН 8,0 и получают 6,9 л раствора (62000 ед., специфическая активность 1,2 ед/мг). Вторым промыванием бентонита 0,5 М фосфатом натрия получают 9,8000 ед. Общий выход 47%.

Элюат (47000 ед.) обессоливают фильтрацией на геле, доводят рН до 5,0 и подают мл влажного сефадекса SE, обработанного 0,05 М ацетатом натрия (рН 5,0), адсорбируют сефадекс SE, гель отфильтровывают и вводят в колонку диаметром 5 см, содерл ащую 1600 мл свежего сефадекса SE в 0,05 М ацетата натрия (рН 5,0). Затем вымывают линейным градиентом из 4 л 0,07 М и 4 л 0,25 М ацетата натрия, рН 5,0. Соединенные активные фракции содержат 36000 ед. чистого энзима со специфической активностью 5,3 ед/мг.

Раствор чистого энзима концентрируют и осторожно добавляют твердый сульфат аммония до наступления легкого помутнения. Кристаллизация происходит при через несколько дней.

Пример 4. Сырой экстракт из клеток Е. соИ концентрируют центрифугированием в густую суспензию и клетки известными способами, а в случае необходимости добавлением 3%-ного метилизобутилкетона переводят в растворимую форму.

610 л сырого экстракта (1,3-10 ед.) разбавляют деионизированной водой до 2100 л, доводят значение рН до 5,0 серной кислотой, центрифугируют и получают прозрачный раствор (1,42-10 ед., специфическая активность 0,42 ед/мг). При рН 5,0 добавляют 13,8 кг бензонита и через 30 мин отделяют в проточной центрифуге. Отделенный бентонит вымывают 90 л 0,5 М раствора ацетата натрия, доводя рН до 8,0, отфильтровывают, получая 92,5 л раствора l, ед. (86%), специфическая активность 1,64 ед/мг.

1 л элюата диализируют в присутствии 0,001 М калийфосфатного буфера при рН 7,0.

Раствор энзима (8250 ед., специфическая активность 1,8 ед/мг) пропускают через колонку, элюируют 2 л 0,01 М и 2 л 0,1 М буфера при рН 7,0, собирая фракции по 25 мл. Пенициллинацилаза содержится во фракциях 110-170°С 1,2 л, 6760 ед. (82%), специфическая активность 6 ед/мг.

Раствор осаждают твердым сульфатом аммония (472 г/л), осадок отделяют центрифугированием и растворяют в воде. Часть раствора (4700 ед.) разбавляют сульфатом аммония до 46%-иого насыщения, отделяют цеитрифугированием до прозрачности и сохраняют при комнатной температуре. В течение недели выпадают кристаллы, их центрифугируют, растворяют в 0,01 М фосфорного буфера и диализируют с тем же буфером 3300 ед.

(70%), специфическая активиость 12,45 ед/мг. Пример 5. 60 л переведенного в растворимую форму сырого экстракта доводят до рП 5,0 и центрифугируют. К отстоявшемуся прозрачному раствору

(155000 ед., специфическая активность 0,3 ед/мг) добавляют ионообмеиник и обессоливают. В этот раствор при рН 5,0 добавляют сначала 200 г бентонита, отделяют центрифугированием и выбрасывают, затем добавляют

еще 800 г бентонита, центрифугируют и вымывают 20 л 0,5 М ацетата натрия (рН 8,0).

Раствор энзима (110000 ед., специфическая активность 1,5 ед/мг) диализируют в присутствии 0,5 М натрийацетатного буфера, довоДят рН до 5,0 и подают на колонку, заполненную сефадексом SEC-50, обработанным 0,5 М ацетатом натрия (рН 5,0). В качестве элюента используют 15 л 0,07 Ми 15 л 0,25 М ацетата натрия, (рН 5,0). Активные фракции

88000 ед. (807о), специфическая активность 4,2 ед/мг (29000 ед.) этого раствора диализируют в присутствии 0,01 М. калийфосфатного буфера (рН 7,0) и подают на колонку с сефадексом А-50 в 0,01 М фосфата калия, рН 7,0.

В качестве элюента используют 0,01-0,1 М фосфата калия (рН 7,0), затем вымывают пенициллинацилазу 21000 ед. (73%), 11,2 ед/мг специфическая активность. Часть раствора (6000 ед.) доводят твердым сульфатом аммония до 45%-ного насыщения. Через две недели на стенках сосуда образуются большие кристаллы. Еще через две недели при комнатной температуре кристаллы отделяют на центрифуге и небольшое количество растворяют в воде 4260 ед. (71%), специфическая активность 13,1 ед/мг.

Пример 6. Элюат бентонита, полученный как в примере 4 (4100 ед., 2,0 ед/мг) диализируют в присутствии 0,05 М ацетата натрия (рН 5,0) и подают на колонку с Lewatit SP-100---Na+.

В качестве элюента используют 0,05-0,5 М ацетата натрия, (рН 5,0). Активные фракции

2020 ед. (56%), специфическая активность 6,6 ед/мг энзима доводят с едким натром до рН 6,5, насыщают твердым сульфатом аммония до 48% и кристаллизуют чистый энзим 1250 ед. (62%), специфическая активность

12,1 ед/мг. 5 Предмет изобретения Способ получения пенициллинацилазы путем разрушения клеток Е. соИ, выделения целевого продукта из сырого экстракта и очи-5 стки хроматографическими методами, от л ичающийся тем, что, с целью повышения 6 : выхода и качества целевого продукта рН экстракта доводят до 3,5-5,5, отделяют осадок, хроматографируют на силикатах алюминия, например на бентоните, и кристаллизуют целевой продукт в присутствии сульфата аммония.