Способ получения - аминокислот Советский патент 1975 года по МПК C12D13/06 

Изобретение относится к получению аминокислот, в частности к -получению оптически чистых L-a-аминокислот.

Известен способ получения Ь-а-аминокислот путем асимметрического гидролиза N-фенацетильных производных L-a-аминокислот (ФАК) в присутствии культуры Е. coli. Однако при использовании известного способа гидролиз N-фенацетильных производпых аминокислот протекает с низкой скоростью при неудовлетворительном выходе продукта.

Для ускорения процесса гидролитическое расщепление N-фепацетильных производных рацематов аминокислот предлагается проводить ацилазами штамма № 9637 культуры Е. coli с последуюпдим подкислением гидролизата и дальиейшую обработку не смешивающимся с водой органическим растворителем проводить до рН рКфАк-1,5, где рКфлк - отрицательный логарифм, константы ионизации фенацетильного производного L-аминокислоты.

Для выделения оптически чистой L-аминокислоты водный слой обрабатывают сильнокислым катионитом, взятым в количестве, обеспечивающим максимальную сорбцию целевого продукта. Десорбцию сорбированной аминокислоты осуществляют в щелочной среде цри рН, равном ,5, где рК2-отрицательный логарифм константы ионизации аминогруппы выделяемой амииокислоты.

Пример 1. Получение L-феиилаланина.

I. Получение фенацетил-фенилаланина. 9,9 г (0,6 моля) фенилаланина при перемешпвании растворяют в 40 см- 2н. NaOH. Затем одновременно прибавляют 16,5 см (0,12 моля) хлорангидрида фенилуксусной кислоты и 100 см- 2н. NaOH. Реакционную смесь перемешивают 50 мин. Во время реакции поддерживают рН 13. Для этого прибавляют еще 40 см- 2 и. NaOn. Реакцию проводят при охлаждении льдом. После окончания реакции реакционную смесь подкисляют концентрированной НС1 до кислой реакции по Конго и оставляют в холодильнике на ночь. Выпавший осадок отфильтровывают и высушивают сначала па воздухе, а затем - в сушильном И1кафу при 40-50 С.

Получают 24,96 г (147% на феиилаланин) вещества. Пигидриновая реакция - отрицательная.

После перекристаллизации из 500 см (30% горячего спирта) получают 12.71 г (47,7% теории, считая па фенила.-1анин) фенацети,тфенилалаиппа.

Т. пл. .

Вычислено азота 4,9%; пайдено 4,8%.

И.Асимметрический ферментативный гндролиз и ионообменное выделение L-изомера из ферментного гидролизата. К 500 мл водного раствора фенацетил-Д, L-феннлаланина с концентрацией 7,2-10-2 М и рН 7,5 добавляют 40 мл суспензии клеток Е. соИ (штамм № 9637) с концентрацией 130 мг/мл. Смесь инкубируют 3,5 ч при 42°С и рН 7,5. Клетки отделяют центрифугированием. Гидролизат подкисляют до рН 2, обрабатывают 1650 мл бутилацетата. К 490 мл водного слоя добавляют 19,5 г катионита КУ-2Х4 в Н-форме. Сорбированный L-фенилаланнн элюируют 60 мл 2н. NaOH при постоянном рН 10,8. Элюат подкисляют до рН 5,6. Нейтрализованпый элюат упаривают до 10 мл в вакууме и при 60°С прибавляют 90 мл спирта. Смесь выдерживают 14 ч при 20°С, выпавшие кристаллы L-фенилаланина промывают спиртом до отсутствия С1-ИОНОВ и сушат нри 70-80°С.

Выход 48%.

Вычислено азота 8,5%; найдено 8,4%.

Удельное вращение (а) -34,2° (С 0,5; Н2О), что соответствует оптической чистоте 99,0%.

III. Рацемизация фенацетил-Д-фенилаланнна. 1,42 г (0,005 моля) фепацетил-Д-фенилаланина -суспендируют в 10 см- воды, содержащей 0,4 г уксуснокислого натрия. К полученной суспензии при 45°С при встряхивании медленно добавляют 6 см уксусного ангидрида. Раствор оставляют стоять 5-6 ч при комнатной температуре, а затем ставят в холодильник. Выпавший осадок отфильтровывают и высушивают. Получают 1,25 г (88,2% теории) вещества.

Т. пл. 119-12ГС.

После перекристаллизации из 150 см (30% горячего спирта) получают 1,01 г вещества.

Т. пл. 127-130°С.

Вычислепо азота 4,9%; найдено 4,9%.

Удельное вращение (сс)в -0,5° (С 2; 5 н. НС1).

Пример 2. Получение L-C-фенилглицпна. Получение целевого продукта отличается от примера 1 тем, что при лодкислении элюатадо рН 4,7 (стадия осаждения L-изомера из элюата) сразу вьшадают К|рИ€таллы L-фенилглицина (L-СФГ). Их промывают ацетоном до полного удаления Cl-ионов.

Выход93%.

Вычислено азота 8,3%; найдено 9,3%.

Удельное вращение (а)® + 168°С (С 1; 5 н. НС1), что соответствует оптической чистоте 99,9%.

Пример 3. Получение L-треонина. Получение целевого продукта отличается от примеров 1 и 2 тем, что L-изомер из пейтрализованного элюата осаждают спиртом. Выпавший после осаждения сниртом осадок перекристалл изовывают из воды и сушат.

Выход 43%.

Вычислено азота 11,8; найдено 11,8%. а)22 28,2 (С 0,5;

Удельное вращение

оптической чистоте Н20), что соответствует 98,9%.

Результаты анализов показывают, что выделенные продукты обладают высокой степенью чистоты.

Формула изобретения

Способ получения L-a-аминокислот путем ферментативного расщенления рацематов N-фенацетильных производных а-аминокислот культурой Е. соИ при пагревапии в слабощелочной среде с дальнейшим выделением целевых продуктов из ферментных гидролизатов ионообменной хроматографией, отличающийся тем, что, с целью ускорения процесса, ферментативный гидролиз проводят ацилазами и1тамма № 9637 культуры Е. соИ с последующим перед ионообменной хроматографией нодкислением гидролизата до рН рКфАК - (1,5±0,5), где рКфлк -отрицательный логарифм константы ионизации фенацетильного производного L-аминокислоты.