Способ получения нерастворимого фермента Советский патент 1976 года по МПК C12D13/10 

мополимера К-акрилоил-б-аминосалициловой кислоты; лактатдегидрогеиаза/гомополимер N-акрилоил-5-амииосалициловой кислоты; .сб-амилаза/титановый комплекс гомополимера М-акрилоил-4-аминосалициловой кислоты; а-амилаза/титановый комплекс гомополкмера -акрилоил-5-аминосалицкловой кислоты; глюкамилаза/титановый комплекс гомополимера Ы-акрилоил-4-амипосалициловой кислоты;глюкамилаза/титаиовый комплекс гомополимера М-акрило«л-5-аминосалициловой кислоты. В процессе использования полимерно-фермеитиые комплексные соединения загружают в колонну, заполненную твердым инертным носителем, например стеклянными бусинами. Пример 1. Взаимодействие комплексной боратной и некомплексной поли-4-кислоты с лактатдегидрогеназой. Водный раствор лактатдегидрогеназы добавляют к суспензии ноли-4-кислоты или ее боратному комплексному производному, немедленно центрифугируют и выделяют твердофазные комплексы: по ли-4-кислота/л актатдегидрогеназа в боратная комплексная иоли-4-кислота/лактатдегидрогепаза. Получение М-акрилоил-4-аминосалициловой кислоты 400 г аминосалицилата натрия и 60 г двууглекислого натрия растворяют в 250 мг дистиллированной воды и размешивают в течение 1 час. Затем к раствору дважды добавляют хлористый акрилоил (20 мл и 10 мл), перемешивая смесь после каждой добавки 1 час рН смеси доводят до 4-5 10 и. соляной кислотой. Затем смесь фильтруют и осадок промывают 500 мл дистиллированной воды. Ы-Акрилоил-4-аминосалициловую кислоту церекристаллизовывают из водного этанола, выход 27 г, т. пл. 227-229С. Вычислено, %: С 58,0, Н 4,35; N 6,76. Найдено, %: С 57,7; Н 4,35; N 6,65. Получение полимера N-акрилоил4-аминосалициловой КРГСЛОТЫ 150 мм акрилоил-4-аминосалициловой кислоты и 9,36 г буры растворяют в 180 мл дистиллированной воды и доводят рН раствора до 9,0 10 Н. едким натром. В полученный раствор добавляют 150 мг азобисизобутиронитрила, растворенного в 50 мл этанола, и нагревают 48 час при 80°С с обратным холодильником. Полученный вязкий раствор разбавляют 200 мл дистиллированной воды. При подкисленинпоследнего до рП 2 5 н. соляной кислотой образуются тяжелые белые хлопья полимера. Осадок 10 раз промывают дистиллиропанной водой, которую всякий раз берут в И-кратном избытке но отношению к объему осадка. Следы борной кислоты удаляют при унариваиии в ротационном испарителе раствора полил1ера в метаноле. Полимер хранят в виде суспензии в 200 мл дистиллированной воды. Для определения содержания воды в полимере последний отфильтровывают и высушивают над пятиокисью фосфора в вакууме при 60°С. После сушки получают твердое, хрупкое, коричневое, прозрачное вещество. Отфильтрованный полимер содержит 93 вес. % воды. Получение боратного комплекса поли-4-кислоты Боратный комплекс полимера получают суспендированием 500 мг отфильтрованного полимера в 1 мл водного раствора буры; рН смеси доводят до 7,0. Образующийся комплекс отделяют центрифугированием. Боратный комплекс получают также и другим способом. Для этого 5 г вязкого раствора, полученного после полимеризации поли-4-кис.лоты, разбавляют 70 мл дистиллированной воды и полученный раствор подвергают диализу в течение 48 час с 10 объемами (по 5 л каждый) против 0,005 М боратного буферного раствора с рН 7,0. Удаление лактатдегидрогеназы из комплекса ноли-4-кислота/лактатдегидрогеназа Образец комплексного соединения г10ли-4кислота/лактатдегидрогеназа, приготовленный вышеуказанным способом, центрифугируют и отделяют твердофазный фермент. Прочность связи фермента с носителем определяют многократно, промывая комплекс 110ли-4-кнслота/лактатдегидрогеназа дистиллированной водой и измеряя активность фермента в промывных водах. Активность определяют но нзменению оптической плотности при 340 нм 0,4 М растворов нирувата натрия объемом в 1 мл, в которые добавляют пробы промывных вод и надосадочной жидкости объемом в 0,5 мл. В заключение комплекс поли-4-кислота/лакатдег;-1дрогеназа промывают 1 мл раствора молочной кислоты, в котором также измеряют активность вышеуказанным способом. Паралель;ю проводят контрольные опыты с испольованием 0,4 М раствора пирувата натрия (оныт А), а также раствора пирувата натрия 1 М молочной кислоте (опыт Б). Концентрация лактатдегидрогеназы в контольных опытах - 0,4 ммоль в 1 мл. Полуенпь;е результаты представлены в табл. 1. Вышеуказанные результаты свидетельствуют о том, что полн-4-кислота п боратнокомплексная поли-4-кислота взаимодействуют с лахтатдегидрогеназой и что лактатдегидрогеназу можно удалить из эти:-; комплексных соединений путем промывки коннеитрировгнным субстратом фермента, например молочной кислотой. Необходимо отметить, что в данном случае комплекс фермент/лолимер не имеет ферментативной активности, хотя и является источником активного фермента. Пример 2. Взаимодействие 1;екомплексной ПОЛИ-4-КИСЛОТЫ и ЛОЛИ-5-КИСЛОТЫ с лактатдегидрогеназой и глюкамилазой. А. Поли-5-кнслоту (5 г) днспергируют в дистиллированной воде измельчителем для ткапи; рН проб диспергированного полимера (1,0 мл) ус1апавливают с помощью 5 и. соляной кислоты или едкого ыатра. В каждую пробу добавляют лактатдегпдрогеназу (10 мл) и выдерживают перед центрифугированием в течение получаса. Осадок дважды промывают дистиллированной водой (1 мл) л после каждой промывки центрифугируют. В заключение полимер дважды промывают 1 М молочной кислотой (1,0 мл) и центрифугируют. В каждом надосадочном слое после центрифугирования опоедглпют активность лактатдегидрогеназы npj: 340 нм. Результаты приведены в табл. 2. Таблица 2

Вышеуказанные результаты показывают, что поли-5-кислота образует комплексные соедцнения по мере увеличения рН от 2 до 9 с увеличивающимся содержанием лактатдегидрогеназы.

Б. Пробу (2,0 мл) суспендированного полимера центрифугируют и осадок дважды промывают уксуснокислым буферным раствором (рН 4,5). В полимер добавляют водный раствор глюкамилазы (1,0 .мл, 18,5 мг/мл) в лактатдегидрогеназе (10 мл), полученную смесь центрифугируют. Осадок дважды промывают водой (1,0 мл) и 1 М молочной кислотой, после каждой промывки проводят центрифугирование. /Тля каждого надосадочного слоя после центрифугироваиия определяют активность лактатдегидроге;:азы и глюка.мнлазы. Полученные результаты приведены в табл. 3.

Среда определения активности фермента

Первый надосадогный слой

То же- -промьшная вода после первой промывки

То же + про.чывпая вода после второй промывки

То же ьпромывной раствор после промывки 1 М молочной кислотой

Из данных таб.т. 3 видно, что образование комплексных соединений фермент/нолимер протекает с лактатдегидрогеназой лучше, чем с глюкамилазой, открывая тем самым путь При рН 7 полп-4-кислота проявляет тенденщгю к

Вышеуказанные результаты показывают, что поли-4-кислота по мере увеличения рН (с 2,0 до 7,0) интенсивнее образует комплексные соединения с лактатдегидрогеназой.

Вес глюкозы, выделяемой стандартным раствором крахмала.

Результаты табл. 5 показывают, что комплексные соединения поли-4-кислоты образуются предпочтительно с лактатдегидрогеназой. а не с гл.(0камилазой. Это указывает на ЁозМо-ЖМЫЙ путь разделения этих ферментов.

Т а б л и ц а 3

Разность онтпческпх плотностей для

глюкамилазы

лактатдегидрогеназы (134 нм) (460 нм)

0,609 0,235

0,039 0,060

для разделения этих ферментов.

В. Опыт проводят по методике примера 2А, lio с нспользоваппем нолн-4-кислоты. Полученные результаты приведены в табл. 4.

Таблица 4

5 Г. Методика опыта аналогична при1меру 2В с :1спользование полн-4-кислоты.

Полученные результаты приведены в табл.5. Таблица 5

Д. Опыт проводят по методике примера 2В с использованием одной глюкамнлазы (1 мл, 18,6 мг) с промывкой уксуснокислы.м б}ферным раствором (2 мл, рН 4-5).

Полученные результаты приведены в табл.6. гелеобразованию. Стандарт 0,92.

Среда определения активности фермента

Первый надосадочный слой

То же + промывной раствор после первой промывки ацетатным буфером

То же-1-промывной раствор после второй промывки ацетатным буфером

Стандарт

Вес глюкозы, выделяемой стандартным раствором крахмала.

Да1н:ные табл. 6 свидетельствуют о том, что поли-5-кислота ate образует комплексных соединений с глюкамилазой (см. приведенный ниже пример).

Получение ноли-5-кислоты

Применявшуюся в вышеприведенных примерах поли-5-кислоту готовят по способу, приведенному в примере для поли-4-кислоты. Отличие состоит в том, что в данном случае используют 5-аминосалицнловую кислоту (40 г), а не 4-аминосалицилат натрия. Выход N-акрилоил-5-аминосалициловой кислоты 25,8 г, т. пл. 218-219°С.

Вычислено, %: С 58,0; Н 4,35; N 6,75.

Пайдено, %: С 57,5, Н 4,5, N 6,5.

Конечный продукт имеет розовую окраску.

Боратнокомплексная поли-5-кислота может быть получена по методу, описанном} в примере 1. Исходным материалом служит 5-амнно салициловая кислота или поли-5-кислота.

Пример 3. Взаимодействие титанокомплексной и некомплексной поли-4-кислоты и ПОЛИ-5-КИСЛОТЫ с глюкозидазой.

р-Глюкозидазу вводят во взаимодействие со следующими образцами:

4А - комплексное соединение полн-4-кислоты с BbicymeiiHbiM титаном;

4Б - комплексное соединение поли-4-кислоты с обезвоженным титаном; Т а б л 11 ц а 6

Активность глюкамнлазы, мг/1 моль

14 5

О 18

4В - некомнлексная поли-4-кнслота;

5А - комплексное соединение поли-5-кислоты с высушенным титаном;

55 - комплексное соединен 5е поли-5-кислоты с обезвоженным титаном;

5В - некомплексная поли-5-кнслота.

Каждый образец (20 мг) промывают пять раз (по 5 мин) дистиллированной водой. В каждый образец добавляют (З-глюкозидазу (1 мг) в дистиллированной воде (5 мл). Смесь размешивают 16 час при температуре около 4°С. Затем смеси центрифугируют. Из исходного раствора фермента и из каждого надосадочного слоя, после соединения фермента с полимером, берут пробы (25 мл). В этих пробах онределяют активность фермента с целью определения прочности связи р-глюкозидазы с полимером. Образцы пять раз промывают (каждая промывка продолжается 5 мин) дистиллированной водой и удаляют надосадочный слой. Затем добавляют 2 мл 0,005 М укс снокнслого буфера (рН 5), и из надосадочного слоя отбирают пробы для определения активности.

Активность Р-ГЛЮКОЗИДНЗЫ в вышеуказанных пробах определяют но скорости образования о-нитрофенил аниона в растворах о-нитрофенил- -у глюкопиранозида. Полученные результаты приведены в табл. 7.

Таблица 7

11

Приведенные результаты показывают, что почти вся содержащаяся в исходном растворе р-глюкозидаза соединяется с полимером.

Десятикратная промывка (по 5 мин каждая) 0,005 М уксуснокислым буферным раствором, 0,1 М уксуснокислым буферным раствором или 0,5 М раствором хлористого кальция не приводит к существенному снижению активности твердофазных ферментов. Однако пять пятиминутных промывок 1 М раствором сахарозы в 1 М растворе хлористого 1гатр я и затем в 0,005 М уксуснокисло.м буфере снижают активность пррг.мерно до 1/3 от наблюдавщегося до промывки уровня.

Использование в примерах 4А, 4Б, 5А и 5Б тнтанокомплексные полимеры готовят следующим образом.

Полученную, как в примере 1, поли-4-кислоту дважды промывают 5н. соляной кислотой, потом дважды дистиллированной водой, а затем суспензируют в 12,5 вес./об. % растворе хлористого титана (10 мл) и размещивают 15 мин. Смесь отфильтровывают для удаления окислительной среды. Остается твердый, окрашенный в оранжевый цвет продукт. Образец делят на две части. Одну часть высушивают в течение ночи в печи при 45°С. Получают образец 4А. Вторую часть оставляют на ночь в эксикатере при температуре 4°С. Получают образец 4Б.

Соответствующее комплексное соединение ПОЛИ-5-КИСЛОТЫ получают по тому же метолу, но с использованием не белой поли-4-кислоты, а розовой ПОЛИ-5-КИСЛОТЫ, полученной в примере 2. Оставшийся после фильтрования остаток имеет темно-коричневую окраску. Образец разделяют на 2 части, обрабатывают вышеоцисанным образом и получают образец 5А (соответствующий 4А) и образец 5Б (соответствующий 45).

Пример 4. Взаимодействие титанокомнлексной поли-4-кислоты и поли-5-кислоты с а-амилазой.

Указанные в примере 3 образцы (20 мг) 4А, 45, 5А и 55 промывают пять раз (по 2 мин) дистиллированной водой (5 мл). Последний надосадочный слой отделяют. В каждый образец добавляют раствор сс-амилазы из Bacillus subtilis (1 мг в 5 мл дистиллированной воды).

Смесь размещивают 16 час при 4°С. Падосадочный слой удаляют и продукт деггерировання промывают пять раз дистиллированной водой (по 5 мл) и десять раз (по 2 мнн) 0,1М уксуснокислым буферным раствором с рН 5 (5 мл).

Твердофазные ферменты суспендируют в 2 мл 0,005 М уксуснокислого буферного раст12

вора с рН 5 и размещивают до получения однородной суспензии. Пробы (по 1 мл для 4А и 5А и но 0,5 мл для 4Б и 5Б) твердофазных ферментов испытывают на активность по конверсии крахмала в мальтозу по методу 5ернфельда и др. (Самуэльсон и Страмберг. Carbohydrate Research, 3, 1966, 89). Актив}юсть твердофазных энзимов 4А, 4Б, 5А, 5Б состав;гяет соответственно; 2,56, 2.27, 1.51 и 4,44

ед/мг.

За единицу активности сс-амилазы нриннмают количество фермента, выделяющееся в 1 мин при 20°С восстановленный сахар, эквивалентный 1 ммолю мальтозы.

Вьпиеприведенные результаты свидетельствуют о том, что о:-амилаза образ ет комплексные соединения с титанокомплексной ГЮЛИ-4-КИСЛОТОЙ и ПОЛИ-5-КИСЛОТОЙ и что полученные таким путем твердофазные ферменты обладают существенной энзимной ферм е н т н о и акт и в н о с т ь ю.

П р и М ер 5. Взаимодействие титанокомплексной ПОЛП--5-КНСЛОТЫ н поли-4-кислоты с глюкомилазой.

Описанный 3 примере 4 опыт повторяют, использовав вместо а-амилазы 5 мл препарата Агидекс глюкамилазы (примерно I мг/мл). Пробы (0,5 мл) однородной суспензии твердофазного фермента в 2 мл 0,005 М уксуснокислого буфера с рП 4,5 испытывают на активность по конверсии крахмала в глюкозу по методу Бернфельда и др. Активность твердофазных ферментов 4А, 45, 5А и 55 составляет соответственно: 0,304, .0,630, 0,323

и 0,450 ед/мг.

За единицу активности глюкамилазы принимают количество фермента, выделяющееся в 1 мин при 45°С п восстановленный сахар. эквивалентный 1 ммолю глюкозы.

Вьинеприведенные результаты свидетельствуют о том, что глюкамилаза образует комплексные соединения с титанокомплексной ПОЛИ-4-КИСЛОТОЙ и что полученные таким образом твердофазные ферменты отличаются

существенной ферментной активностью.

Изменение активности твердофазных ферментов, в зависимости от частоты их использования, оиределяют путем суспендирования продукта диспергировапия после определения активности в 0,1 М уксуснокислом буферном растворе (5 мл, 2 мин), удалени;г надосадочного слоя, суспендиоования продукта диспергирования в 0.005 М уксуснокислом буферном растворе рН 5 ( мл)

и повторного определения активности. 3aieM эту операцию повторяют еще два раза. Результаты измерения снижения актнвиости Св процентах от исходной) приведены в табл. 8.

13

Приведенные данные показывают, что поеле потери начальной активности на 30- 40%, ферментативная активность твердофазHL.X ферментов остается при последующем использовании на полезном и достаточно постоянном уровне. Такие твердофазные ферменты используют, обеспечения экономическую эффективность, в течение 10-20 час.

Пример 6. Гомополимер М-акрилоил-4аминосалнциловой кислоты в комплексном соединении с титаном, приготовленный описанным ниже образом, промывают пять раз дистиллированной водой (5 мл, по 2 мин) п последний надосадочный слой удаляют, к осадку добавляют 5 мг сс-амилазы в дистиллированной воде, продукт диспергирования размешивают 16 час при 4°С. Из каждого падосадочного слоя берут пробу (25 мл), в кототой определяют активность фермента по конверсии крахмала в глюкозу. Используют метод Бернфельда и др.

Твердый материал промывают 10 раз 5 мл 0,1 М уксуснокислым буферным раствором, рН 5,0 по 2 мин. После удаления последнего падосадочного слоя продукт диспергирования суспензируют в 2 мл 0,005 Al уксуснокислого буферного раствора (рН 5). Пробы (500 мл) продукта диспергирования испытывают описанным выше образом на активность фермента.

Результаты измерений активности фермеп.тов приведены ниже в табл. 9.

Комплексное соединение гомополпмера -акрилоил-4-ампносалициловой кислоты и титана, которое используют в данном оныте, готовят следуюп,им образом.

К-Акрилоил-4-аминосалициловую кислоту (15 г) суспендируют в дистиллированной воде (130 мл), в которую затем добавляют буру (9,35 г). рИ доводят с помощью 10 н. едкого иа;ра до 9,0. Затем добавляют а.-: хобисизобутпронитрил (150 мл) в этаноле (50 мл) i; раствор нагревают 48 час на водяной бане при 80°С. Раствор разбавляют дистиллированной водой (200 мл) и добавляют к нему 2 н. соляную кислоту. Осаждают полимер белого цвета.

путем декантации промывают десять раз дистиллированной водой (11 порций), затем в ротационном испарителе вынаривают 3 этанола пять раз подряд, после чего полимер суспендируют в дистиллированной воде. Выход продукта 14,2 г (сухой вес).

14 Таблица

1 г полученного полимера размешивают 20 мин с 12,5 вее./об. % раствора хлористого титана (10 мл). Получают твердый продукт оранжевого цвета, который отфильтровывают и промывают дистиллированной водой (100 мл). Выход продукта 980 мг (сухой вес).

Пример 7. Описанный в примере 6 способ используют для получения комплексного соединения гомополимера N-aкpилoил-5-aминоеа.тициловой кислоты с титаном. Получают гомополимер розового цвета и комплексное соединение гомополимера н титана красновато-коричневого цвета.

Результаты измерений активности этих ферментов представлены в таб.т. 9.

П р и м ер 8. Опнсанный в примере 6 способ используют для получения комплексного соедннення гомополимера Х-акрилоил-4-аминосалицг,ловой кнслоты с титаном. N-Акрилоил-4-аминосалициловую кислоту (1 г) суснендируют в дистиллированной воде (20 мл) н рН доводят до 9,0. На этой стадии опыта мономер растворим. В раствор вводят азобисизобутиронитрил (10 мг) в этаноле (10 мл). Затем 48 час смесь нагревают на водяной бане при 80°С. Осажденный 2н. соляной кислотой белый осадок полимера промывают дпстиллпрованной водой (250 мл) путем декантации.

1 г полимера размешивают с 12,5 вес./об. % раствора хлористого титана (10 мл) в течение 20 мин. Полученный желто-ораплчевый твердый продукт отфильтровывают и промывают дистиллированной водой (100 мл). Выход продукта составляет 612 мг (сухой вес).

Пример 9. Оп11санный в примере 8 с .особ используют для получения комплексчого соединения гомополимера Х-акрилоцл-5-ам;:носалиинловой кислоты с титаном, прг.меияя при этом не 4-аминокцслоту, а N-акрплоил 5аминосал1щиловую кислоту.

Результаты измерений активности твердофазного фермента приведены в табл. 9.

Пример 10. Описанный в примере 6 способ используют для полученпя комплексного соединения гомонолимера Ы-акрнлоил-4-амипосалициловой кислоты и титана. N-Акрилопл-4-ам1Шосалицпловую кпслоту (1 мг) суспендируют в дистиллированно воде (20 мл) и устанавливают рН 10н. едким натром до постояиной величины 4,5. В полученный раствор добавляют азобисизобутиронптрил (10 мг) в этаноле (10 мл). Раствор нагрева 15

ют 48 час па водяной бане при . Пос..с разбавления раствора днстнллнровашю водой (20 мл) добавляют 12,5 вес./об. % раствора хлористого титана (20 мл). При этом в осадок выпадает желто-оранжевое комнлексное соединение титана. Его отфнльтро16

Ре.чу.Пзтаты измерения активности твердофазны.х ()н нривсдены в табл. 9.

Таблица 9 П р и .4 е ч а н и е. В качестве субстрата фермента во всех глюкозы.

Пример II. Описанный в примере 10 способ используют для получения комп.лексного соединения гомополимера К-акрнлоил-5аминоеалициловой кислоты с использованием вместо 4-аминокислоты N-aкpилoил-5-a.ми 0салициловой кислоты.

Формула изобретения

--Х--(СО)„-CR CRiR2,

где R, RI н R2 - независимо водород, алкил. содержащий от 1 до 6 атомов углерода, или галоген; п 1 или 0;

X--кислород, сера, иминогрупна или метилен.

карбоксильных грунп, используют комплексы гомонолимеров N-акрилонл-4-аминосалициловой кислоты или К-акрилоил-5-аминосалицилопой кислоты с солями титана или бора. иримера.х используют 520мг