Способ получения белково-пептидногоКОМплЕКСА Советский патент 1981 года по МПК A61K38/28 A61K35/39 

1

Изобретение относится к биологической промышленности.

Известны различные способы получения белково-пептидного комплекса, содержащего кристаллический инсулин, используемого в терапевтических целях, а также для стимуляции мясной продуктивности сельскохозяйственных животных 1-3.

Использование инсулина в последней стадии откорма сельскохозяйственных животных повышает интенсивность углеводного, азотистого и жирового обменов и использование питательных веш,еств организмом, что приводит к увеличению привеса животных на 5-15%.

Наиболее близким к предлагаемому способу является способ 4, предусматриваюш,ий водно-спиртовую экстракцию поджелудочной железы с использованием серной и ортофосфорной кислот, отделение балластных примесей при рН 4,5-4,7 и рН 4,2-4,8 путем добавления 10%-ного раствора ацетата цинка, осаждение инсулинасырца солями цинка при рН 4,2-4,5 и 5,4-5,5 высаливание 20-25%-ным раствором хлорида натрия и дальнейшую кристаллизацию инсулина известным способом.

Недостатком известного способа является то, что введение инсулина, не содержащего проинсулина и глюкагона, методом имплантации у животных вызывает резко выраженную гипогликемию, а введение животным одного инсулина путем инъекции или имплантации приводит к быстрому рассасыванию и разрушению его ферментами тканей животных, что снижает степень использования и резко сокращает продолжительность эффекта.

Целью изобретения является повышение биологической активности белково-пептидного комплекса за счет наличия в его составе инсулина, проинсулина, глюкагона, нротамина и цинка.

Цель достигается тем, что целевой продукт осаждают солями тяжелых металлов вначале при рН 6,0-8,0, а затем повторно при рН 5,5-7,5 и в присутствии протаминсульфата при рН 6,0-8,0.

Подкисление экстракта проводят серной

кислотой до рН 2,5-3,5 в течение 20-

30 мин и соляной кислотой до рН 2,0-2,5

в течение 120-150 мин.

Отделение балластных веществ от экстракта проводят при рН 5,0-10,6, преимущественно при рН 6,0-7,5.

Полученный белково-пептидный комплекс при анализе методом электрофореза в полиакриламидном геле характеризуется

наличием фракций, соответствующих инСулину, проинсулину, глюкагону. Кроме того, в препарате имеются пролонгаторы инсулина и глюкагона, а также протамин и соли цинка. Использование предлагаемого способа позволит упростить технологическую схему получения белково-пептидного комплекса по сравнению с известной для инсулинасырца, повысить выход и снизить себестоимость препарата. Применение белково-пептидного комплекса при откорме сельскохозяйственных животных не вызывает у них резко выраженной гипогликемии, повышает использование питательных веществ и увеличивает привесы, что обусловлено наличием наряду с инсулином проинсулина и глюкагона. Присутствие в комплексе протамина и цинка снижает степень разрушения гормонов тканевыми ферментами и обеспечивает продолжительный эффект препарата. Пример 1. 1 кг поджелудочной железы крупного рогатого скота или свиней измельчают и экстрагируют 3,5-4,0-кратным объемом 70-85%-ного раствора этилового спирта, подкисленного 45-59 мл концентрированной ортофосфорной кислот, в течение 3 ч. рН экстракционной смеси 2,8-3,0. Экстракт фильтруют и дважды осаждают в нем балластные веш,ества и соли при рН 5,8-6,0 и рН 9,5-10,2. Выпавшие осадки удаляют фильтрацией или центрифугированием. Из надосадочной жидкости осаждают белково-пептидный комплекс при рН 5,8- 7,5, добавляя 80-100мл 10%-ного раствора уксуснокислого цинка. Полученный осадок отделяют, промывают дистиллированной водой и растворяют в воде, подкисленной соляной кислотой. Полученный комплекс очиш,ают высаливанием 20%-ным раствором хлористого натрия при рН 2,5. В дальнейшем проводят переосаждение его при рН 5,5-7,5 и комплексообразование с протамин-сульфатом при рН 7,0-7,5. Для этого к растворенному белково-пептидному комплексу добавляют 225 мл раствора, содержаш,его 103,5 мг протамин-сульфата, 94,5 г двузамеш,енного фосфата натрия, 67, 5 мг хлористого цинка и 0,14 мг фенола. Полученный препарат отделяют и высушивают. Выход препарата 600 мг. Содержание гормональных компонентов в комплексе следуюш,ее,%: инсулина 40-60, проинсулина 20-30, глюкагона до 10. Суммарное содержание гормонов 20-30%, протамина 10-15% и цинка до 5% от веса препарата. Пример 2. 1 кг поджелудочной железы крупного рогатого скота или свиней измельчают и экстрагируют 5-кратным объемом 80%-ного раствора этилового спирта, подкисленного 75 мл смеси концентрированных серной и соляной кислот в соотношении 1:1, в течение 3 ч. рН экстракцибй ной смеси 2,5. Экстракт фильтруют и осаждают в нем балластные белки при рН 5,8-6,0 и рМ 9,5-10,2. Выпавшие осадки удаляют фильтрацией или центрифугированием. Из надосадочной жидкости осаждают белково-пептидный комплекс при рН 5,8-7,5 добавлением 80-100 мл 10%-ного раствора уксуснокислого цинка. Полученный осадок отделяют, промывают дистиллированной водой и растворяют в воде, подкисленной соляной кислотой. Полученный Комплекс очиш,ают высаливанием 20%-ным раствором хлористого натрия при рН 2,5. В дальнейшем проводят переосаждение его при рН 5,5-7,5 и комплексообразование с протаминсульфатом при рН 7,0-7,5, как в примере 1. Полученный препарат отделяют и высушивают. Выход препарата 700 мг. Соотношение компонентов в препарате такое же, как в примере 1. Пример 3. Измельчают 1 кг поджелудочной железы крупного рогатого скота и суспендируют в 5 л 80%-ного этилового спирта. К суспензии добавляют 5 мл концентрированной серной кислоты и перемешивают в течение 20 мин, затем добавляют 10 мл 18%-ной соляной кислоты и перемешивают еш.е 160 мин. Нерастворимую часть отделяют центрифугированием и отбрасывают. В надосадочной жидкости доводят рН до 5,5 добавлением 20%-ного раствора едкого натра. Через 1 ч образовавшийся осадок отделяют центрифугированием и отбрасывают, а в надосадочной жидкости доводят рП до 10,0 добавлением едкого натра. Выпавший осадок отделяют центрифугированием и отбрасывают. В надосадочной жидкости рН снижают до 6,0 и при перемешивании добавляют 100 мл 10%-ного раствора уксуснокислого цинка. Выпавший осадок отстаивают в течение 5 ч, верхний слой декантируют, а нижний центрифугируют. Выход влажного сырца 12 г. Его суспендируют в 120 мл воды и рН доводят до 2,2-2,4 добавлением 18%-ного раствора соляной кислоты. Нерастворимую часть отделяют центрифугированием и отбрасывают, а к надосадочной жидкости добавляют 45 г хлористого натрия и перемешивают до полного растворения соли. Выпавший осадок отделяют центрифугированием, а маточник отбрасывают. Осадок суспендируют в 120 мл воды и добавлением 8%-ного раствора соляной кислоты рН доводят до 2,5-2,8. Полученный раствор фильтруют через кизельгур, а к фильтрату добавляют 5 мл 10%-ного раствора уксуснокислого цинка и рН доводят до 5,5. Через 5 ч осадок отделяют центрифугированием, а маточник отбрасывают. Осадок суспендируют в 75 мл воды и доводят рН до 2,8-3,2 добаблением 18%-ного раствора соляной кислоты. К раствору добавляют 2 мл 5%-ного раствора хлористого цинка, 2,5 г глюкозы, 0,3 г фенола и рН доводят до 3,3-3,5. Затем к раствору добавляют 30 мл 0,25%-него раствора протамин-сульфата, а рН доводят до 6,0. Выпавший осадок через 10-12ч отделяют центрифугированием. Маточник отбрасывают. Осадок промывают ацетоном и сушат. Выход порошка 650 мг, содержание гормональных веществ (типа инсулина и глюкагона) в нем 25%. Пример 4. Измельчают 1 кг поджелудочной железы свиньи и полученный фарш суспендируют в 4 л 85%-ного этилового спирта. Суспензию подкисляют 10 мл концентрированной серной кислоты и перемешивают в течение 30 мин, затем к суспензии добавляют еше 60 мл 18%-ного раствора соляной кислоты и продолжают перемешивать 150 мин. Нерастворимую часть отделяют центрифугированием, а в надосадочной жидкости рН доводят до 7,0 добавлением едкого натра. Выпавший осадок балластных вешеств отделяют центрифугированием и отбрасывают. К надосадочной жидкости добавляют 80 мл 10%-ного раствора уксуснокислого цинка при рН 6,8. Осадок отделяют центрифугированием и маточник отбрасывают. Осадок растворяют в воде при рН 2,0-2,2, нерастворимую часть отбрасывают, а к раствору добавляют хло6ристый йатрий До 0,8 насыщёйия. Выпавший осадок отделяют центрифугированием, опять растворяют в воде и из водного раствора осаждают добавлением уксуснокйСлого цинка при рН . Осаждение протаминсульфатом проводят при рН 7,0. Вес сухого порошка белково-пептидного комплекса 750 мг. Содержание гормональных веществ (типа инсулина и глюкагона) 43%. Пример 5. Процесс проводят по примеру 3, но для подкисления водно-спиртового раствора берут 6 мл серной кислоты и 40 мл соляной кислоты, балластные вешества отделяют только при рН 7,2, а целевой продукт - солями цинка при рН 6,3. Для высаливания продукта из водного раствора используют 20%-ный раствор хлористого натрия. Второе осаждение солями цинка проводят при рН 6,0, а осаждение протамин-сульфатом - при рН 7,2. Выход белково-пептидного комплекса составляет 800 мг из 1 кг свиной поджелудочной железы при содержании гормональных веществ около 48%. П р и м е р 6. Процесс ведут по примеру 2, но для подкисления водноспиртового раствора берут 20 мл серной кислоты. Другие значения рП, как в примере 4. Выход белково-пептидного комплекса 500 мг при содержании гормональных веществ 25%. Физико-химические свойства отдельных серий, полученных как в примере 4, представлены в таблице.

При введении гормонального препарата, содержащего 93-95% белково-пептидного комплекса из поджелудочной железы животных на 5-7%-ной стеариновой кислоте для откормочных животных свиней, путем одноразовой имплантации таблеток в последние 90-120 дней откорма в дозе для бычков 160 мг, бычков-кастратов 200, телок 250 мг привесы молодняка были выше, чем у контрольных животных на 9-12%, в сравнении с имплантацией инсулина привесы были выше на 3-4%.

Одновременно с увеличением привесов имплантация метаболина повышала убойный выход на 1,2-1,6%, а в мясе - содержание белка и жира.

Применение метаболина методом одноразовой имплантации на молодняке свиней в последние 90-120 дней откорма в дозе для боровков 50 мг, для свинок 60 мг увеличивало привесы на 13-16%, убойный выход на 1,2-2,2%, в мясе содержание белка и жира по сравнению с контрольнымы животными. Использование инсулина Содержание инсулина и глюкагона определено методом бумажной хроматографии. Состав белковых фракций определен методом электрофореза в полиакриламидном геле, где содержание белка принято за методом имплантации оказалось не эффективным. При производственной апробации метаболина на 1 тыс. голов молодняка свиней в последнюю стадию откорма были получены аналогичные результаты. Экономический эффект от применения метаболина в расчете на одну голову молодняка крупного рогатого скота составил 8-12 руб., молодняка свиней - 5-7 руб. Формула изобретения 1. Способ получения белково-пептидного комплекса из поджелудочной железы убойных животных путем экстракции ее водноспиртовым раствором с одновременным подкислением экстракта и последующим отделением нерастворимой части, отделением балластных веществ из экстракта и осаждением высаливанием целевого продукта солями тяжелых металлов, отличающийся тем, что, с целью повышения биологической активности белковопептидного комплекса, осаждение солями прово510 15 20 25 дят вначале при рН 6,0-8,0, а затем повторно при рН 5,5-7,5 и в присутствии протаминсульфата при рН 6,0-8,0. 2.Способ по п. 1, отличающийся тем, что подкисление экстракта проводят серной кислотой до рН 2,5-3,5 в течеиие 20-30 мин и соляной кислотой до рН 2,0-2,5 в течение 120-150 мин. 3.Способ по п. 1, отличающийся тем, что отделение балластных веществ от экстракта проводят при рН 5,0-10,6, преимущественно при рН 6,0-7,5. Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1. Авторское свидетельство СССР № 332832, А 61 К 17/04, 1972. 2.Ковалевская П. Т. Влияние инсулина на мясную продуктивность п некоторые показатели обмена веществ. Автореферат, Львов, 1965. 3.Обыденов В. А. Использование инсулина при откорме свиней - «Животноводство, 1969, № 11. 4.Авторское свидетельство СССР № 351547, А 61 К 17/02, 1969.