Способ получения фиксированных на носителе биологически активных макромолекулярных соединений Советский патент 1976 года по МПК A61K38/43 A61K31/78 C08J5/24 

г--:-;1 с-п находится нэ поБерхыос-i.fc-:a, ;1оскольку лишь тогда он бе y-i .юступен для веществ, кеобхо.и :,Сук;естБления взаимодействия. г.;-.:. активный протеин, заключен п confJni-iMGpa, проявляет свою ак.Ti.iib Е очень малой степени и определенных условиях. Эти усло:шя заключатотся Б том. что необходимые /1ля реакции пошества должны иметь возможность пподпффупдировать через поры сшитого с- полимера и к тому же достигнуть сох.г.юченного в сополимере активного поотокн;.. Соаершенно очевидно, что высоко 1ть;й субст-рат не может проник;ь сшлтого сополимера, но даже гкулярг.ые субстраты вступают во iCTiiHe очень медленно, поскольку происходит диффузия через кзои;)Сгоиие устраняет указанный Оно создает возможность того, .ТО весь г.испогкчески активный протеин располагается в связанном состоянии на Поверхности образовавшегося сополимера и лишь в неакачительном количестве находится внл,-ри этого сополимера. Это достигается nyTov пополннтольного применения материала, представляюшего собой молекулярное сито, лорь которого так малы, что примененный биологически активный протеин не может лройнкать в них. IIpe,:iJiaraev;biH способ изготовления макромоле}чулярпь1х соодинений, фиксированных на носителе, состоит в том, что макромолекулярные сосдипонкя А сначала подвергают Г .заимодействкю с соединением Б, которое имеет по меньшой мере одну функциональную груплу, способную соединяться с макромолекулярным соединением А и, кроме того, име ет по меньи1ей мор.е, одну cnocoSnyjo к поли меризации функциональную группу, затем добавляют молекулярное сито с такой степенью сшивкн (или размером пор), что через него не проник;.;;от молекулы макромолекулярного соединения А и, в слу-чае необходимости, спо coCi::..:;: }- сооолимеризации мономер, молекулярное скто Ha6vxaeT в реакционной среде, затем осуществляют полимеризацию заключенн1лх внутри молекулярного сита соединений. Таким образом, liiiiif-iaioi: макромолеку.шрное соединенно, фиксированное на носителе, ковалентнс; связанное с поверхностью час 1ИЦ полимеризата, который проникает в частицы молекулярных сыт. Макромолекулярные соединения А в соответствии с изобретением - это протеин, осоfiOHHO биологически активiibifl протеин, форыенты, гормоны, и антитела, нуклеиновые кислоты, пептиды, порфирины, гемины, фосфати.- ды, цереброзиды, ганглюозиды, глюкозиды и т.д. Существенно, что макромолекула так велика, что она практически не может проникнуть в поры примененных молекулярных сит. Минимальная величина применяемых по изобретению соответствующих макромолекул поэтому зависит от размера пор применяемых молекулярных сит. Особенно предпочитаемые макромолекулы - это биологически активные протеиньг, в частности ферментно-активные протеины. В качестве соединения Б можно применять большое число соединений в зависимости от способности к взаимодействию с макромолекулярным соединением А. а также от вида получаемых сополимеров. Если макромолекула А содержит, например, аминокислоты, то применяют соединения, которые имеют способные к взаимодействию группь, такие как оксирангруппы, этиленимингруппы. галогенидгруппы, галогенидкислотные, азидккслотные ангидридкислотные группы. ДальнейЩИ6 примеры показывают применение для ашширования или алкипирования аминогрупп в пептидную и протеиновую группы, таких соединений как альдегиды, гидразиды, оксазалоны, смещанный хлормуравьиный эфир, эфир угольной кислоты с вторичным фосфорнокислым эфиром, вторичным мышьяковым эфиром, гидроксинитриловый эфир уксусной кислоты, N -гидроксисукцинамид, р-нитрофенол, полигалогенфенолы, дициклогексилкарбодиимид и фенилтриазин. Кроме того, смешанные ангидриды угольной кислоты с серной кислотой, имидазолид угольной кислоты. При использовании других макромолекулярных соединений в соответствии с имеющимися, способными к соединению функциональными группами, применяют другие подходящие алкилирующие и ацилируюшие агенты. В случае нуклеиновых кислот допускаются по существу те же самые активные группы, как те, что применяются при протеинах и пептидах. Особенно подходят здесь амиды кислот, такие как нормальный амид угольной кислоты, алкиламид, морофолид и т.д. Многофункциональное соединение Б может иметь одну или несколько групп, способ i i-x. к соединению с макромолекулярным соединением А. Оно имеет предпочтительно группь одного вида. Кроме того, это соединение должно содержать группу, способную к полимеризации или поликонденсации. Уто, прежде всего. двойные связи углерод-углерод, преимущест венно, которые могут вступать в реакции гомополимеризаики и сополимери.зацйи, а также двойные связи углерод-кислород, как в карбонилгруппе и др; ОН - группы, изоцианатгруппы и капролактамгруппы и т.д. Примерами соединений Б являются: 2,3-эпоксипропиловый эфир акриловой кислоты, 2,3 бутеноксид, 1-ащ1илокси-3-( N -этилениминпропанол-2), ангидрид малеиновой кислоты, амилбромид, акрилоилхлорид, 2,3-эпоксипрогшловый эфир метакриловой кисло ты, 2,3-эпоксипропиловый моноэфир малеиновой кислоты, 1-(аллилокси)-2,3-эгюксибу тан и т.д. Применяемые молекулярные сита должны иметь размер пор, не позволяющий проникат макромолекулярному соединению А и позволяющий проникать внутрь полифункционально му присоединяющемуся соединению Б. Предпочтительно это гелевидные молекулярные сита на основе сщиты.х волимеров, такие как полиакриламидгель, сшитый углевод, на пример сшитый декстран, агар и т.д. Спосо ным к полимеризации мономером может быт акриламид, метакриламид, эфир акриловой кислоты и метиловый эфир акриловой кислоты, стирол и т.д. с соответствующим количеством сшивающего агента, как например, N, М -метилен-бис-акриламида, тетраэтиленгликольдиметилкрилата или этилендиакрилата, дивинилбензола и т. л. Размер пор регулируется количеством сшивающего аген та, причем с повьшшнием этого количества радиус пор сита уменьшается. Предпочтительны молекулярные сита на основе сшито го декстрана и производных акриловой кисл ты и метакриловой кислоты, особенно амид и эфира. Молекулярные сита перед полимеризацией полностью или частично подвергают набуханию, так как полимеризация или сополи меризация соединения Б должна протекать внутри молекулярного сита и потому осуществляют набухание молекулярных сит таким образом, что поглощается раствор, в котором происходит соединение макромолекулярного соединения А с соединением Б, так что на поверхности молекулярных сит остается только макромолекулярная часть продукта А Б. Объем реакционного раствора выбирают таким, что полного набухания молекулярных сит не происходит, так что этим обеспечивается прохождение окончательной полимеризации исключительно внутри молекулярных сит. Путем соответствующей комбинации моле кулярного сита с соединением Б и способной к полимеризации системой, а также в случае необходимости растворителя, можно каждый раз по желанию осуществлять полное заполнение и проникновение полимери- зата в молекулярное сито или только поверхностное проникновение при остающемся незаполненном полом пространстве внутри молекулярных сит. Способная к полимеризации система выбирается каждый раз с зчетом сохранения в силе нужных свойств макромолекулярного соединения А, к примеру ферментной активности, допускаемых условий полимеризации, особенно температуры полимеризации и полпмеризационных свойств способного к полимеризации соединения Б. Если в качестве гaкромолекулярного соединения А применяют тносительно термостабильную нуклеиновую кислоту, то можно пригодное для полнконденсации при нагревании соединение Бпрлм нять в качестве единственного элемент;1 системы полимеризации. Если макромолекулярное соединение А это термочувствительньдй фермент, то целосообразно работать в условиях сополимеризации с применением подходящих сомономеров, например, акриламида в присутствии низкотемпературных катализаторов полимеризации, например, перекисей и, в случае необходимости, ускорителей и ош вающих агентов. В качестве инициаторов используют обулчные инициаторы и катализаторы, применяемые в полимерной химии, которые не оказывают отрицательного влияния на активность макромолекулярного соединения А. В качестве инициаторов или катализаторов применяются неорганические или органические перекиси, азосоединения и т.д. Дополнительно могут быть применены ускорители реакции, такие как амины и др. При применении производных акриловой или метакриловой кислот в качестве соединения Б, обладающего способностью к полимеризации, оказалось наиболее удобно применить комбинации инициаторов из пероксидисульфата и амина. Применение сшивающих агентов в полимеризационной системе не является необходимым, так как полимеризация внутри ячеек молекулярных сит придает получаемому полимеру свойства сетчатого полимера. Однако для модификации физических свойств все же целесообразно применять сшивающий агент. Полученное фиксироваииое на носителе макромолекулярноо - -::- mie имеет превосходную повегтх .1 : : тивность. П р и м Исходи.:i .. : Молекулярло1с сптс. iiO основе образующего сетчатыо юлэку„;ы декстрана. Глюксла - олоттдаза (22О U /к-fr) N, N -метилен бис-акриламид Хлорид акриловой кислоты Хлористый метилен Дисульфат перекиси аммония. М -Диметиламинопропионитрил. 1ОО мг глюкозы - оксидазы растворяют в 5 мл 0,5М триэтаноламии-буфера, рН 8,0 в атмосфере азота охлаждают до 10 С. К этой реакционной смеси добавляют О.ОЗм хлорида акриловой кислоты в 2 мл метиленхлорида и 30 мин перемешивают. В этом протеиновом растворе, обработанном хлоридом акриловой кислоты, растворяют 0,8 г акриламида и 0,05 г N, N -метилен-бис-акриламида. Проводят полимеризацию с 0,05 мл 5%-ного N -диметиламинопрошгонитрилового раствора, а также с 0,05 мл 5%-ным оаствора перекиси дисульфата амлоония. Сразу после этого добавляют к реакииоыной смеси 5 г молекулярных сит (сэфадекс Q -2.5., среда) и перемешивают в атмосфере азота. Объем реакционного раствора выбирают таким образом, чтобы его было недостаточно для полного набухания молекулярных сит и не образовалось единого полимеризационного блока, но произошла полимеризация исключительно в гранулах молекулярных сит. Полученные частицы суспендируют в 5О мл дистиллированной воды, перемешивают, фильт руют и .аиофилиаяруют. Са. 5 г (в Выход: Молекулярные сита пересчете н« лиофилизат). Удельная активность 160 и/г лиофилнзата. П р и м е р 2 (для сравнения). Исходные продукты: Сефадекс Q- -25, среда Глюкоза - оксидаза (220 U /мг) Бромцнан, К 3 т сефадекс Q -25 среды добавляют 75 мл водь; я 1ОО мл 2 5%-ного раствора бромццана. Значение рН становится ра 1П-.1М 11 и путем дозирования 2 н. натро- |:с.й ше.То-чи по,1яерживают рН в течение 6 ;ин постоянным. Промывают ОД М раст1. глдрокарбоката натрия. Сефадекс, актИБирои.-иный бромцианом, смешивают с 200 мг г.чюкозы - оксид азы, растворенной в 10 V.--; 0,3 М гриэтаноламин буфера,рН 8,0. ГЧ-акаиоиную смесь оставляют на 18 час о при 4 С. Промывают 0,2 М днфосфат-буфером, рМ 7,5. Удельная активность полученногч; 1 .зким образом фермента, соединенного с нос;ич :лем, составляет 38 О/г. Г-еакиия фиксирования протеинов ка сшитом акт;;й;5рованием бромцианом полиса.хари,:.(- jiaccjMaTpsibaeTCH как способ с сохранени ем нанЕиясшей активности. Сравнение примеров 1 и 2 показывает что. несмотря на уд- военное количество фермента, содержащегося на носителе, по известному способу получен продукт с активностью на 25% ниже активности, полученной по предлагаемому способу. Полученный на введенном ферменте выход активности в 8 раз выше. Пример 3. Исходные продукты: Молекулярные сита на основе полиакрилГлюкоза-оксидаза (220 U/мг) Акрил амид N,N -метил ен-бис-акриламид Хлорид акриловой кислоты Метиленхлорид Дисульфат перекиси аммония N -диметиламинопропиэнитрил. Инкубирование раствора фермента производят, как указано в примере 1. Сразу после добавления раствора инициатора добавляют 5 г молекулярных сит (биогель Р6 5010О меш) и перемешивают в атмосфере азота. Набухание молекулярных сит происходит в течение нескольких секунд. Объем реакционного раствора выбирают таким образом, чтобы не было достигнуто полного набухания молекулярных сит, чтобы не образовался единый полимеризационный блок, а полимеризация протекала исключительно в гранулах молекулярных сит. Полу- ченные частицы суспендируют в 5ОО мл дистиллированной воды, энергично перемешивают и фракционируют двумя типаг-лх сит с шириной ячейки 0,4 и 0,2 мм. Частицы 0,2-0,4 мм заполняют колонку диаметром 20 мм и элюируют 4 л 0,2 М фосфат-буфера; рН 7,5. Выход. Молекулярные сита Са. 5 г (в пересчете на сухую массу, удельная активность 16 О и/г (в пересчете на сухую массу). Пример 4. Фиксацияполиадениловой кислоты (поли А) Исходные продукты: Поли Л Триэтаноламинбуфер (0,5 М, рН 8,0) Акрилоилхлорид Акриламид Дисульфат перекиси аммония (5%) N, м -бис-акриламил Диметиламинопропионитрил (5%) Сефадекс G -25, среда. 27,4 мг Поли А растворяют в 2 мл триэтаноламин-буфера и охлаждают до 10 С. Этот реакционный раствор добавляют в атмосфере азота в 0,01 мл акоилоилхлорида, растворенного в 1 мп эфира и перемешивают 30 мин. Окончательно смешивают с 0,3 г 910

акриламида и 0,2 г N , N -метилен - бис -кулярных соединений путем взаимодействия

-экриламида и 2 г сефадекс -25 и на-биологически активного макромолекулярного

чинают полимеризацию с 0,02 мл диметил-соединения А с низкомолекулярным соединеаминрнропионитрила и 0,02 мл дисульфатанием Б, содержащим но меньшей мере одну

нерекиси аммония. Полученный нродукт в гра-5групну, способную к полимеризации, и по

пулах вводят около 8 час в колонну и промы-меньшей мере одну группу, способную к взавают2,5л 0,5 М раствора поваренной солиимодействию с макромолекулярным соединеДля доказательства фиксирования суспен-нием А, с последующей полимеризацией продируют сефадексом соединенный Поли А вдукта взаимодействия АБ в растворе, о т 0,3 н. раствора едкого калия и гидролизуют 10личающийся тем, что, с целью увев темноте при 37 С.личения биологической активности фиксированПосле гидролиза получают нуклеиновуюно го на носителе соединения, к раствору прокислоту, концентрация которой (10%) вычис- у ДБ перед полимеризацией добавляют

лена по привесу Поли А.молекулярное сито с размером пор в набухПредложенный способ дает возможность 15 состоянии, меньшим размера молекулы

экономить дорогой и во многих случаях труд-макромолекулярного соединения А, в колинодоступный биологически активный протеин,честве, достаточном для неполного набухапоскольку он весь связывается на поверхнос- растворе продукта А Б. . Способ по п. 1, о т л и ч а ю Формула изобретения к и с я том, что полимеризацию продук1. Способ получения фиксирОБ :г - ;u)та АБ проводят в присутствии сополимериносителе биологически активных мак; . -.оле-зующегося с ним соединения.

526294