Способ получения связанных носителем протеинов Советский патент 1975 года по МПК C08H1/00 

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СВЯЗАННЫХ НОСИТЕЛЕМ

ПРОТЕИНОВ

3

получен в салюм водном растворе полимериJruntoii вплоряс 1,(1|)имых мономеров. Прн этом прсд1111|ти1слыи1 осуществляп, предлагаемый способ превращения протеина с эпоксидным соединепнсм в присутствии полимеризующегося мо 1омера (или мономеров), или полимеризую ннйся лгономер (или смесь мономеров) добав; ят1)СЯ в реакционный раствор лишь пас.те )е,кннн между нротеином и эпоксидным спсдилепнем.

Д;1Я осуолествления предлагаемого способа прсдпочтите.тьпы эпоксидные соединения общеь форлгулы

. :

C.

в KOTOpoii Ri означает алкиленовый радикал с одной или несколькими двойными связями, алкиленоксирадикал или ненасыщеннвш ацильиый радикал; п - 0,1 или 2; Rg - атом водорода илп низплая алкильная группа (под Hi-Bineii алкильной грунной понимается прямая 1-1ЛИ развствлспная группа с 1-4 атомами углерода). Группа RI содержит преимущественно 2-6 атомов углерода. Однако могут нримепятъся и более длинноценочные радикалы, поскольку при этом водорастворимость эпоксидного соедииения уменьшается незначительно.

Примерными групп Ri могут служить аллилОКСИ-, метилаллилокси, этилаллилокси-, диметилаллилокси-, метилэтилаллилокси, проиилаллилокси- и диэтилаллилоксигруппы, а также другие аллилоксигомологи, предпочтительна ацильная группа, в которой оксигруппа находится в сопряжении с двойной связью. Подобные группы RI образуются, например, от а,3-ненасыщенных кислот таких, как акриловая, метакриловая, фумаровая и малеиновая ккслоты.

Примерами соединений общей формулы I являются 2,3-эпоксипропиловый сложный эфир акриловой и метакриловой кислот, 2,3-эпоксиироппловый сложный моноэфир и диэфир малеиповой кислоты, 2,3-эпоксипропиловый сложный мопоэфир и диэфир фумаровой кислоты, 2,3-эпоксибутиловый эфир акриловой кислоты, 2,3-эпоксипентиловый сложный эфир акриловой кислоты, 2,3-эпоксигексилсвый СЛОЖНВ1Й эфир акриловой кислоты, соответствуюпще эфиры метакриловой, (|)умарово1 | и малеиновой кислот, 1-(аллилoi;cn)-2,3-Э11оксибута11 и т. п.

Особенно предпочтительны в качестве мономеров водорастворимые нроизводные акрилоHoii плп метакриловой кислоты, например амнды п сложпые эфиры этих соединений. Соединени5 с ограниченной водорастворимостью нл-еют преимущество в том случае, когда применяется связанный носителем фермент в нечисто водной системе, например в водно-оргаiiH4ecKoii среде. Пригоды также соответствую4

щие производные малеиновой или фумаровой кислоты.

В зависимости or требуемо консистенции конечного нродукта к мономеру добавляют

сшивающий агент, содержащий более одной нолимеризующейся груипы, например N,N-Meтиленбисакриламид и диэтиленакрилат, которые предпочитают при работе с водным раствором. Если полимеризацию ведут в гетерогепной фазе, т. е. в суснепзии, могут нримепяться такие водонерастворимые еп:ивающие агенты, как дивппилбензол п зтилендиметакрилат и др. Полученные по предлагаемому способу протеипы, связанные носителе:м, не

образующим сшивки, можно сшивать дополнительно.

Взаи.модействие протеипа с эпоксидным соединением не требует особых мероприятий: нротеин и эпоксидное соединение можно вводить вместе при нор.лшльной температуре в водный раствор, целесообразно в буферный водный раствор с величиной рП, приемлемой для соответствующего JipOTenna. Продолжительность взаимодействия протеина и эпоксидкого соединения зависнт от применяемых веществ и колеблется от 5 мин до 1 час, ио в отдельных случаях может быть более продолжительной или более короткой. Взаимодействие нротенна и эпоксидного соединения можно вести в нрисутствии носителя или исходных продуктов для получения носителя. В последнем случае нецелесообразно начинать реакцию полимеризации добавкой ицициатора после образования промежуточного продукта протеина с эноксидным соедипепием. В качестве инициаторов могут примепяться употребляемые обычпо в химии полимеров инициаторы и катализаторы, так как они не оказывают отрицательного влияния на

активность протеина. В качестве инициаторов или катализаторов при применении мономеров с ненаевшденными олефиновыми связя.ми или форполимеров используют, например, неорганические или органические нерекиеи, азосоединения и т. д. Могут применяться также ускорители реакцпп, в частности амины и т. н. Использование инициаторов в комбинации из перекисного сульфата и амина, нанример 3-диметила.мииопронионитрила, нредпочтительно.

При применении нпициаторов в этой комбинацпи целесообразно вести процесс в ипертной атмосфере, например в атмосфере азота. Продукт получают ii)ocTijiM отфпльтровыванпем п 1громывкой.

По предлагаемому сцособу чувствительные протеииы и протеиновые соединения, наприме) ферме1ггы, люжно связывать без большой нотери их активности. При фиксации на носи1елях подобных чуветвительпых протеинов но

известным методам ночтн во всех случаях они дезактивируются или получаемые препараты имеют небольшую стойкость и ограниченную активность. Преимущество получаемых по изобретению продуктов состоит в том, что во

время прон,ессов их пабухаппя и другнх проueccoB ферментное или протеиновое соединение сохраняется. Это ироявляетея, например, в том, что при фиксации фермента уреазы на ДЕАЕ-целлюлозе по известному триазиновому способу нолучают продукт с активностью 4,9 ед./г, а но нредлагаемому - с активностью 1200 ед./г при той же ферментативной активности. Причем и после хранения в течение нескольких недель при температуре 34°С продукт не теряет активности. Аналогично по известному способу можно фермент глюкозаоксидазу с активностью 300 ед./г лиофилизата связывать с целлюлозой. Но после 11 дней хранения активность снижается менее чем на половину. По предлагаемому способу, используя одинаковые количества фермента, можно нолучать продукты почти с удвоенной активностью. Такие продукты сохраняются более 6 месяцев в готовой форме как катализаторы без существенного уменьшения активности.

Продукты, получаемые по изобретению, стойки к поражению микроорганизмами, режим набухания их управляемый, что важпо, если продукты применяют для насадки колонны, кроме того, они обеспечивают легкое регулирование требуемого заряда или отсутствие заряда. Преимущество способа состоит также в простоте его осуществления.

Пример I. Исходные вещества: глюкозаоксидаза (GOD, 220 ед./мг) акриламид, 2,3эпоксипропиловый слолсный эфир акриловой кислоты, М,Ы-метиленбисакриламид, 3-диметиламинопропионитрил, перекисный сульфат аммония.

0,1 г GOD растворяют в 2 мл. 0,5 М буферного раствора триэтаноламина (рН 8,0) в атмосфере азота при 30°С, смещивают с 0,25 мл 2,3-эпоксипропилового сложного эфира акриловой кислоты и перемещивают 30 мин. Затем охлаждают до 10°С, смещивают с 3 г акриламида и 0,1 г К,Н-метиленбисакриламида, растворенного в 18 мл дистиллированной воды.

В атмосфере азота приблизительно через 15 мин начинается полимеризация при помощи 0,5 мл 5%-ного 3-диметиламинонропионитрила и 3 мл 5%-ного перекисного сульфата аммония. Раствор приблизительно через 5 мин становится вязким, затем он нолимеризуется в желтьп прозрачный и твердый гель. Блок полимеризации оставляют на 18 час в холодильном П1кафу. Далее полимеризат нродавлипают сквозь металлическое сито с отверстиями диаметром 0,5 мм и промывают 2000 мл дистиллированной воды. Частички геля помещают в колонну внутренним диаметром 2 см с 0,2 М буферным раствором фосфата калия (рП 7,5), промывают адсорбционно связанной GOD, пока активность элюата не будет равна нулю. Ферментативная активность связанного носителем фермента (лиофилизата) 500 ед./г.

Пример 2 (сравнительный пример). Повторяют пример 1, однако не вносят эпоксидное соединение.

3,0 г акриламида и 0,1 г N,N-мeтилeпбиcaкриламида в 18 мл дистиллировагпюй воды

смешивают, перелгешивая и замораживая с 0,1 г GOD, раствореипой в 2 гл 0,05 М буферного раствора триэтанолампна (рП 8,0). Затем, как в примере I. в атмосфере азота добавляют раствор инициатора, п продукт обрабатывают, как описапо в прпмере 1. Активпость элюата около 40% от активности введеппого GOD. После лиофилизагши полученного продукта актиБПОсть лпофилпзата составляет от 9dдо 100 ед./г.

Пример 3. 1-1с.ходпые вещества: GOD-1, 220 ед./мг, акриламид, 2,3-эпоксппропиловый сложный эфир акриловой кислоты, Х,Х-метилеибисакрпламид, 3-диметиламинонроппонитрил, нерекпсны) сульфат аммония.

0,15 г GOD в 1,5 л днстиллпрова1пкп 1 воды и 1.5 мл 1,0 М буферного раствора триэтаиолампна (рН 8,0) охлаждают в атмосфере азота до 10°С. Этот раствор разбавляют 3,0 г акриламида и 0,1 г К,Х-метпленбисакрплампда, растворенного в 14 мл воды. При добавке в реакционный раствор 0.25 л 2,3-эпоксппропилового сложного эфира акриловой кислоты, 0,5 мл 5%-ного З-диметиладгинопроппопитрила и 0,2 мл 5%-ного перекнсного сульфата аммоппя начинается реакция полимеризации. Время иолимернзации около 10 мин. Полимеризационный блок продавливают сквозь металлическое сито и обрабатывают, как оиисано в примере 1. Определенпе активпостн элюата показывает, что связывается ковалептно 100% протеииа. Активность лиофилпзата 140 ед./г.

Пример 4. Псходные вещества: GOD-1, 200 ед./г, акриламид, 1-(аллилокси)-2.3-эпоксинропан, ,1 -метпленбпсакриламид, 3-диметилампнопрогпюнитрил, нерекисньи су,чьфат аммония.

50 мг GOD в 0,5 .мл дистиллировапной воды и 0,5 мл 1 М буферного раствора триэтаполампна (рП 8,0), раствореппые в атмосфере азота при 30°С, и 0,1 мл 1-(аллнлокси)-2,3эпоксипронана выдерживают 40 мин, зате: 1

охлаждают до , смешивают с 3 г акриламида и 0,1 г N.N-метиленбпсакрилампда, растворенного в 20 мл бпдистиллнрованпой воды. Дальне1п1 ую обработку ведут, как описано в 1. Активность элюата составляет 10% от активности использованного фер ieптa. Активность лиофилизата 210 ед./г.

Пример 5. Псходпые вещества: урпказа, 4,5 ед./мг, раствореппая в 50%, глицерина. 0,05 М глицин п 0.13 Д раствор Ха2СОз, акрнламид, 2.3-эпоксппроп ловьп | сложны эфир акрил OBofi кислоты. Х.Х-метиле б1 Сакриламид, 3-ди eтнлaмнпoпpo П oнптp л, ерекис ЬП1 сульфат аммония.

10 уриказы подвергают диализу i 1 л

0,01 лМ буферного раствора гл1П1И 1а (рН 10) при 4°С около 4 час. Дпалпзат смешива от с 1 мл 1 М буферного раствора тр)этанолам 1па (рП 8,0). При в атмосфере азота выдержива от получеп 1ую смес с добавлением

0,1 мл 2.3-э110ксп рО П5лового эфира

7

акриловой кислоты при перемегпиваини в течение 30 мни. Обработку ведут по 1. Активиоеть лиофилизата 3,5 од./г.

Пример 6. 1--1сходиые вещеетва: гекеокипаза, 140 ед./мг, акриламид, 2,3-эпоксипрои 1ловый сложный эфир акриловой кислоты, ,Nметилепбисакриламид, З-диметиламиноиропионитрил, иерекисный суль(1)ат лмиония.

20 мг суспсизии кристаллов гексокииаз1 ; растворяют в 5 мл воды и иодвергают диализу в 1 л 0,01 М буфериого раствора триэтаиоламииа (рН 8,0) при 4°С, В присутствии 2,3эиоксииропилового сложного эфира акриловой кислоты выдерживают иолучеииую смесь в атмосфере азота ири 10°С с охлаждеиие, после 30 мии выдерживания до 10°С. Раствор фермеита смешивают с 3 i акриламида и 0,1 г Ы,Ы-метилеибисакриламида, раствореииого в 20 мл диcтиллиpoвaIИIoi воды. Дальне1 пиую обработку ведут ио иримеру 1. Лктивиость лиофилизата 12 ед,/г,

Пример 7. Пеходиые вещества: глюкозаоксидаза, 220 ед,/мг (GOD), 1,2-эиоксибутеи3,4, акриламид, N,N-метил енбисакрил амид, 3-диметиламииоироииоиитрил,1герекисиый

су.аьфат аммоиия.

100 мг GOD в 2 мл 0,5 М буфериого раствора триэтаиоламипа (рП 8,0), раствореипоГ в атмосфере азота ири 30°С, и 0,05 -мл 1,2-Э110ксибутена-3,4 выдерживают в течеиие 30 мии. Затем охлаждают до 0°С, смешивают с 3 г акриламида и 0,125 г .N-мeтилeибиcaкpиламида, раствореииы л- в 18 .мл бидистилли)ованпой ВОДВ1. ДалвиеГииую обработку ведут ио примеру 1. Активность элюата 37% «т исрвоначальиой активности исходного фермента. Активность лиофилизата 540 ед./г.

Пример 8. Исходные вещества: глюкозаоксидаза, 220 ед./мг, эноксииронилоиый елож8

ный эфир акриловой кислоты, акриламид, Х ,М-метилеибисакриламид, 3-диметиламиионроииоиитрил, иерекисиый сульфат аммония.

100 .мг глюкозаокеидазы, растворенной в атмосфере азота ири 30°С в 2 мл 0,5 М буфериого раствора триэтаиоламина (рП 8,0), и 0,25 мл 2,3-эноксинронилового сложного эфира акриловой кислопз выдерживают 30 мии. Затем раствор иереводят в диализную камеру диализная трубка (Калле-целлофан) и дважды иодвергают диализу в 1000 мл 0,05М буферио1ч-) раетвора трнэтаиоламина, рН 8,0. Предзарительио иикубироваинви раствор ферл;ента (объе.м 10 мл) охлаждают до , объем дополняют до 20 лгл бидистиллироваииой водой, сл еи1ивают е 3 г акриламида и 0,15 г ,К-метилснбисакриламида. Далее процесс ведут ио примеру 1.

Активность элюата 5% от первоначальной aKiTiiiHOCTH 1:еиользоваииого фермента. АктивHocii) лиофилизата 305 ед./г.

Ире ;1, е т :i.-; о б р е т е н и я

Liiocoo Ч)лучеиия евязагщых носителем протеинов иутел 1 заимоде| 1етвия нротет-гов с сое,ini-ienne: i. содержанлим эпоксидную грунпу и способную к сополимеризаини двойиую связь, о т л и ч а К) щ н 11 е я тем, что, с целью иолучеиия бпологическп активиых иродуктов, в качестве 1)о1еиног) исиользуют биологичееки активные п|к)теппы и процесс осуществляют в водной среде, а нолучеииый иродукт иодвергают с;пнвап по нутс.м взаимоде11етвия с акриламндом н.ли дпфуикциональным спп-гваюшим агеп iOAi.