Способ получения полимерных носителей протеинов Советский патент 1978 года по МПК C08F222/04 

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИМЕРНЫХ НОСИТЕЛЕЙ ПРОТЕИНОВ реакции с алкеноксидами с 2-8, предпочтительно 2-4 атомами углерода или со смеся ми таких алкеноксидов, причем к- 1 молю не сущих гидроксильные группы соединений приполимеризовывагот , предпочтк«тельно алкеноксидных структурных элементов. В качестве пригод1гых алкенокси дов назвать окись этилена и окись п|эопилена. Можно использовать также про- дукты реакции по Церевитинову соединений, содержащих не менее двух активных атомов водорода и полученных не из спиртов или фенолов, с вышеназванными алкенокси- дами с получением ди- и/или поли(мет)акри яатов. Используемые согласно изобретению дни поли(мет)акрипаты ди- и полиолов получают известными методами, например путем реакции ди- и/или полиолов с хлоридом (ме акриловой кислоты в присутствгии примерно эквимолярных (в расчете ,на хлорид кислоты количеств третичных аминсз, например трИчГ этиламина. Реакцию проводят при температурах шоке 20 С в присутствии бензола. В качестве ди- и полиолов, содержащих не менее 2, предпочтительно 2-12 атомов углерода, можно использовать этиленгликоль пропандиол-1,2; пропандиол-1,3; бугавдиолы в частности бутандрол-1,4, гександиолы, декандиопы, глицерин, триметилолпропан, пентаэригрит, сорбит, сукрозу и продукты их реакции с названными выше алкенсжси- дами. Пригодны также поли-бис-хлорметил- оксациклобутан или полистирол оксид. Можно применять смеси ди- и полиолов. Предпочтительно использовать диакрилаты и диметакрилаты диолов, имеющих 2-4 атома углерода, и/или продукты реакции 1 моля этих диолов с 1-20 молями алкеноксида с 2-4 атомами углерода в ;молекуле, а также триметилпропантриметакрилат. Особенно целесообразно применять диметакрилагы .; этиленгликоля, диэтилен- гликоля, триэтиленгликоля, тетраэтиленглн- коля или высших полиалкенгликолей с мол. весом до 1ООО, а также указанных соединений. При желании наряду с ди- и/или поли (мет)акрилатами можноиспользовать обычно применяемые сшивающие среды, имеющие не ivfeHee 2 несопряженных двойных связей, а именно дивиниладипат, метилен бнс-акриламид, триакрилформаль или триаллчлиианурат, примешиваемые в количестве примерно 0,1-30% от веса смеси мономер Пользуясь возможностью весьма широко варьировать состав смеси мономеров, можно иамснягь гидрофш1ьнсх;ть, плотность , набухаем ость и содержание ангидридных групп в получаемых сополимерах в соогаегствии с их конкретиы( «л;м ач«ниом. Сополймеры по предлагаемому способу могут быть попучеЕ1ы, папркмпр, путем (Х:ад(тельной полп.меризакии в органическом рас ТВ оря теле i причем полимеры начинают выпадать вскоре после начала полимеризаций. 8 принципе пригодны ;побые инертные к ангидридным группам растворители. Наиболее целесообразно использовать алифатические, циклоалифатические, ароматические углеводороды, а также галогензамещенныеуглеводороды, алкилароматические вещества и сложный эфир карбоновсй кислоты. Примеры подходящих растворителей: гептан, октан, изооктан, фракции бензина, кипящие примерно при 60-200 С, циклогексан, бензол, толуол, ксилол, хлорбензол, дихлор- бензол, этилацетат, бутилацетат. Растворители должны иметь точку кипения не менее 60 С и легко удаляться в вакууме из осажденного полимера. На 1вес.ч. смеси мономеров примен5пот от 2 до 50, предпочтительно 5-20 вес.ч. растворителя. Вид и количество использованного растворителя существенно влияют на насыпной вес, удельную поверхность и другие свсйства сополимеров. Во многих случаях желательно применять смеси названных растворителей. Полимеризацию можно начинать в растворителе полимера, а потом непрерывно в ходе полимеризации добавлять осадитель полимера Осад и гель можно также вводить в определенные моменты однсй или несколькими.порциями. Смесь мономеров можно вводить вместе с подходящим инициатором (в виде расгвора или без растворителя) в определенное количество растворителя. Тогда в процессе полимеризации получается равномерная незна|1ительная концентрация мономера. Применяя (мет/акриловые мономеры с разной гидрофильностью и варьируя условия полимеризации, можно получать продукты с очень щироким, соответствующим их конкретному назначению, диапазоном набухаемости, плотности. удеяьнсй поверхности и с хорощей механическсй стабильностью. Сополимеры но изобретению могут быть получены также методом суспензионной полимеризации. Наиболее часто применяемый вид бисерной полимеризации, в ходе которой мономеры (при необходимости с добавкой органических растворителей) суспендируют в воде, в данном случае мало эффективен,поскольку ангидрид очень быстро .гидролизуется, полученная дикарбоновая кислота переходит в основном в водную фазур лишь в незначительной степени внедряется в структуру полимера. Суспензионную полимеризацию целесообразно поэтому проводить в органичог:КОЙ сррде. Мономер и инициатор растворяют в носмачивающемся парафинами, инертном к ангидридным группам растворителе, например ацетонитриле, димегилформамиде, диме-, тилсульфоксиде, триами е гексаметилфосфорной кислоты,и распределяют - большей частью с добавкой диспергаторов - в связанней фазе. В качестве связанной фазы наиболее пригодны парафиновые углеводороды, например гептан, октан и их высшие хгомологи, циклоалифатические соединения, например пиклргексан,а также смеси парафине, например фракции бензина или парафиновое масло. Объемное соотношение связанная мономерная фаза составляет от 1:1 до 10:1, предпочтительно JT 2:1 до 5:1. Для стабилизации суспензии можно использовать, например, .глицеринмоно- или диолеаты и их смеси, сорбитанмоно- и триолеаты и стеараты, простой моноэфир полиэтиленгликоля со стеарил- или/ лаурилспиртом или нонилфенолом, сложный моноэфир полиэтиленгликоля с олеиновой, стеариновой и другими жирными кислотами, со;держащими более 1О атомов углерода, а также натриевые соли сложного диоктилсжого эфира сульфоянтарнсА кислоты. Зти, вещества применяют предпочтительно в количестве 0,1-10% (в расчете на количество смеси мономеров); растворяются эни обыч- 1но в углеводорода ей фазе. Величина частиц суспензионных полимеров может быть уменьшена не только увеличением скорости переме шивания, но и добавкой 0,1-2,0% (в расчете на количество мономеров} дополнительного поверхностно-активного вещества, например алкилсульфоната. Полимеризация возбуждается радикальным HHBnHatojxJM. Пригодными инициаторами являю ся азосоединения преимушественк нитрил аз изомасляной кислот 1, или персоединения, гла ным образам диацилперекиси, например дибензоилперекись, или перкарбонаты, например диизопропил- или дициклогексилперкарбонат. Для инициирования полимеризации можно также испольасжать диалкилперекиси, гидро перекиси и эффективно действутогаие в органи ских растворителях сжислИтельно-восстане)вительные системы. Инициаторы вводят в количестве 0,01-10 предпочтительно 0,1-3% от веса смеси моно меров. Полимеризацию осуществляют при темпера турах 50-1ОО С (в :аависямости от скорости- распада инициаторов), болыией частью ниже температуры кипения растворителя. При бисерной полимеризации используется гемпеpaVypa Ниже температуры смещения обеих фа Желательно осуишствлять полимеризацию в атмосфере инертного газа, в отсутствие кислорода. Полученные путем осадительной полиморизации сополимеры имеют слегка желтоватый цвет или бесцветны. Это иорогпкосбрааные вещества с насыпным объемом от 1,5 до 30, чаще от 2 до 20 мл/г, удельней поверхнек;тью О,1-5ОО, чаще от 1 до . Титрометрически определенное после омыления ангидридных групп содержание карбоксильных групп составляет от. 0,02 до 10, преимущественно от О,4 до 2 мг-экв./г. Сусйензионные полимеры представляют собой белые или слегка окрашенные бусинки, иногда неправильной формы, диаметром 0,03-1, чаше от 0,О5 до 0,6 мм, с насыпным объемом ежещо 1,4-8, чаще 1,4-5 мл/г. Определенное после гидролиза ангидридных групп содержание гидроксильных групп составляет О,О2 - 10, преимущественно от 0,4 до 4 мг-экв/г. Полученные по изобретению сополимеры содержат статистически распределенные сополимёризааионные структурные элементы. В связи с высокой плотностью поперечных связей эти сополимеры не растворяются ни в каких растворителях. Их молекулярный вес не поддается поэтому определению. Сополимеры набухают в воде до 1,1-2,5кратной величины их насыпного объема. Они прекрасно подходят для использования в качестве смол-носителей для фиксирования веществ, способных вступать в реакцию с ангидридными группами сополимеров. Смолы-носители МОЖНО вводить при температуре от О до 30 С непосредственно в водный раствор связываемого вещества, предпочтительно в водный раствор протеина; рН должен при эте)м поддерживаться на постоянном уровне. Для связывания протеинов с сополимером целесообразно использовать рН-стат с уровнем рН от 3. до 10, предпочтительно от 5,5 до 9,0. При применении в качестве протеина пеницнллинанилазы рН целесообразно поддерживать на уровне 5,7-6,8. Для поддержания постоянного рН в процессе реакции связьгеания необходимо непрерывно добав/ лять оснсфанйе. Для этого можно «спользовать неорганические основания, например растворы едких щелочей, и органические нования, например третичные арганиче.ские Пример. 80 г гетраэтиленглккольдиметакрилата, 2О г ангидрида малеиткэвой кислоты и 1 г нитрила азоизомасляной кислоты растворяют в 1 л бензола и перемешивают в течение 4 час при 60°С. Затем добавляют 1 г нитрила аао 13омасляпсй кислоты и 200 мл бензина (т.кип. 100140°С ). Псшимериэшшю ггродолжают еще 5 час при 7 О С. Порошкообразный полимер отсасываЕОТэ взмучивают один раз в бензоле и три раза в пегролейном эфире (т кип. 3O-SO С) и сушат S вакууме. Выход 94 г. Свойства папимераг Насыпной объем, iWwi/r-Э б Объем набухания в воде, мл/г, 2 Удельная поверхность, м /г5,О Содержание карбоксильных групп после омылений ангидрид .ныхгрупп .3,5 П р и м е р 2. Раствор 9О г эгиленглй кольдиметилайрилата, 10 г ангидрида новой кислоты. И: 1 Г нитрила азоизомасля- ной кислоты в 1 л , бензола сначала переме шивают при 60 С. Спустя 4 час добавляю 200 мл бензина (т.кип. 100-140 С) и Д. нитрила азоизомасляной кислоты и полиме ризуют еще 2 час при 70 С и 2 час при . Полученный полимер отсасывают тщательно промывают петролейным эфиром (т. кип. 30-5О°С)и сушат в вакууме. Вы ход 97 г. Свойства полимера:;.: Насыпной объем,: МП Ур6,4 Объем набухания и воде Мл/гSjO Удельная поверхность,, м /г298 Содержание карбоксильных групп после омыления ангид- рЙДНЫХ групп, МГ-ЭКВ./Г1,5 Пример 3. В результате сополимеризации 90 г диэтилеНгликольдиметакрилат с 10 г ангидрида малеиновой кислогьз Б условиях.примера 2 получедо 96 г продукт Свойства полимера: Насыпной объем, мл/гSjS Объем набухания в воде, му1/г6,7 Удельная поверхность, м7г9,2 Содержание карбоксильных групп после омыления ангидридных групп, мг-экв/г.1,9 Пример4.80 г тетраэтиленгликол димеТакрилата, 20 г ангидрида малеиновог кислоты и 1 г порофора растворяют в 1 л бензола и медленно перемешивают 16 час при 8О С. Полимер подвергают обработке, аналогичной описанной в. примере 1. Выход продукта 95г. Свойства полимера: Насыпной объем, мл/г2,5 Объем набухания в воде, мл./г3,0 Содержание карбоксильных групп после омыления вЕПидридных групп, мг-эквУ г2,6 П р и м е р 5. В снабженном мешалкой сосуде нагревают в течение 1 час до 90°С 1л бевзша Ст.кип. ЮО-МО С) н 1 г нкфила, азокзомаспянсй кислоты. Загем прк. температуре 80 С в гечеяие 3 час вводят по каплям раствор 95 г этиленгликольдиметакрйлвт-Эа S г ангидрида малеиновой кислогы и 1 г Нитрила ааонзомас.пяной кислоты к перемешивают прк этсй же температуре еще 2 час. Полимер отсаеываютв многократно отмь®а ч ют бензолом и петролейньгм эфиром (т.кип. 3050 С) и сушат в вакууме. Выход продукта 96 . Свойства полимера: Насыпной объем, мл/г 15,0 Объем набухания в. воде, мл/г1852. Удельная поверхность, м /г7О Содержание карбоксильных групп 1П1Х;ле омыления ангидридных групп МГ/-ЭКВ/Г 0,5 Примере. Раствор 62,5 г тетраэтилeнгликoльди feтaкpилaтa, 37,5 г днгидрида малеиновой кислоты и 1 г нитрила азоиаомасляной кислоты в 150 мл бугилацетата и 1 л бензина (т.кип. 1ОО-140 С.) перемешивают в течение 2 час при 7 О С, 2час при 75 Си 1,5 час при 90 С. Полимер отсасывают, экстрагируют в течение 24 час в экстракторе С оке лета и сушат в-вакууме.,Выход продукта 77 Г. Свойствадолимера: Насыпн.ой объем, мл/г 7,3 Объем набуханияв воде, мл/г8,2 Удельная поверхность, м /г19,4 Содержание карбоксильных групп после омыления ангидридных групп, мг-экв, Приме р 7. Раствор 90 г тетраэтилен- гликольдиме -акрилата, Юг ангидрида малеиновой кислоты и 1 г нитрила азоизомасляной кислоты Б 200 мл ацетонитрила суспендируют в 1000 мл бензина (т.кип. 100-140 C)i в котором было растворено 5 г смеси глипе- ринмоно-и диолеата. Реакционную смесь поли7 меризуют до образования твердых бусин .око ло 2 час при и дополнительно 20 час при . . . . Полимер отфильтровывают, трижды промьк вают бензолом и трижды петролейнътм эфиром (т.кип. 30-50 С) и сушат в вакууме при 90 С Выход продукта со средним диаметром частиц около 0,35 мм составил 94 г, Свойства полимера: Насыпной объем, мл/г2,8 Объем набухания в воде, мл/г3,1 Удельная поверхность, м /г3,4 Содержание карбоксильных групп после омыления ангидридных групп,мг-акв./г1,5 П р и м е р 8. 18 г эфира диметакрнловой кислоты и окиси полипропилена с мол. весом 1000 (число ОН-групп 112), 2 г ангидрида малеиновой кислогы и 200 мг витрвла ааояаамаспяясй киспоты помещают в ампулу, воздух вытесняют азотом и ампулу : паивают. После нагревания в течение 20 час до 65°С ампулу разрушают, полимернзатный блок измельчают, трижды суспендируют в ацетоне к сушат при температуре 50 С и давлении 5О торр. Выход полимера 18 г. CBdicTBa полимера: Насыпнсй объем, мл/г2,3 Объем набухания в воде, мл/г2,5 Содержание карбоксильных групп после омыления ангидридных групп, ./г1,6 ; 0 JS Формула обретения Способ получения полимерных носителей протеинов путем бисерной сополимеризапий «5С;уЭ-моноолефиновых ненасыщенных ангидридов дикарбоновой кислоты с ненасыщенным соединением в среде органических раствс ителей в присутствий инициаторов при нагревании, отличающийся тем, что, с целью получения сшитых полимеров, в качестве ненасыщенного соединения испол1 зуют ди- или полиакрилат или ди- или попиметакрилат ди- или полиолов в количестве ЗО-99% от веса мономеров и процесс проводят при 5О-100°С.