(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНШ АНТИБИОТИКОВ ионов сульфата и карбоната кальция оказывает блатч приятное влияние. В процессе ферментации и выделения антибиотика проводят биологические анализы с применением штамма K2ebcJeB2aaerogenejS |(проба KAG). Целевой продукт получают из фильтрата культуры. Все этапы выделения и очистки антибиотика должны протекать при темпера туре не выше 12®С. Для разделения антибиотического компле са можно применять различные известные способы. На иболе.делесообразной после дов тельностью стадий является адсорбция на угле, экстракпия с переносчиком, хроматография на целлюлозе. Пример. Получение ММ 4550 (комплекс). 5treptoniyces АТСС 3112 выращивают в течение 7 суток при темпера туре 28 С в колбе Ру на поверхности тве дой агар-агаровой среды следующего состава (в г/л): Дрожжевой экстракт1О, О Моногидрат глюкозы10,0 Агар-агар15,0 Вода водопроводная, лДо 1 рН среды до стерилизации 6,8. 50 мл стерильной деионизированной воды, содержащей 0,О2% Твин 80, пряливакхг к культуре в колбе Ру, и споры суспендируют БСтряхиванием. Полученную суспензию микроорганизмов прибавляют для вы ревания к 75 л стерилизованной среды в б дильном чане емкостью 100 л. Состав ферментационной среды(в г/л); Мука из соевых бобов10,0 Моногидрат.глюкозы20,0 Водопроводная вода, лДо 1 Для предотвращения вспенивания в ферментационную среду до ртерилизации добав ляют 5О мл 10%-ного Плуроника в соевом масле.j, Среду стерилизуют водяным паром в бро дильном чане в течение 20 мин при температуре 120 С. Культуральную перемешивают со скоростью 340 об/Мин и скоростью аэрации 15О л/мин. Инкубирование осуществляют при температуре 28°С в течение 45 час. 7,5 л полученной культуры вносят в 150 л стерильной среды в бродильном чане емкостью ЗОО л. Состав ферментационной среды (в г/л): Соевая мука10,0 Моногидрат глюкозы20,0 Мел0,2 Хлористый кобальт0,001 Вода водопроводная, лДо 1 Для предотвращения вспенивания добавляют 300 мл 10%-ного Плуроника 81 в соевом масле. Продукт ферментации собирают через 48 час и осветляют центрифугированием. 100 л осветленного раствора перемешивают с 12 кг ионообменной целлюлозы Baiv ман ДЕ 32 в ацетатной форме. Шлам фильтруют, и комплекс ММ 455О элюируют с целлюлозы 12 л 0,5 М раствора сульфата калия. Экстракт концентрирую до 6 л в выпарном пленочном аппадате в вакууме при температуре ниже ЗО С. Сульфат калия осаждают 12 л ацетона. Раствор фильтруют и концентрируют до объема 200мл вьшариванием в вакууме при температуре ниже 30°С. Концентрат загружают в колонку (76 мм X 2 м), заполненную смолой Амберлит ХАД-, и элюируют деионизированной водой, собирая элюат фракциями по 140 мл. Активные фракции собирают вместе (2,2 л) и концентрируют до 275 мл путем ультрафильтрования через мембраны Амикок V М - 0,5 .(d 150 мм) под давлением азота 420 н/м . Концентрат высушивают вымораживанием, получают 2,2 г коричневого порошка ( J, 0,004 мкг/мл). 1 г порошка растворяют в 1 л 0,2 М раствора сульфата натрия и смешивают с 1 л 2%-ного (вес/обьем) раствора кислого сульфата тетра-н-бутиламмония в дихлорметане. Дихлорметановую фазу отделяют по весу, охлаждают до температуры - 7 , фильтруют для удаления льда и концентрируют выпариванием до 20 мл. К концентрату прибавляют 400 мл петролейного эфира с т.кип. 40-60°С, и осадок собирают фильтрованием. Осадок вторично растворяют в 10 мл дихлорметана и экстрагируют 10. мл воды, содержащей йодистый барий (80 мг) и карбонат бария (70 мг). Фазы разделяют, водную фазу фильтруют .и величину рН устанавливают на уровне 6,5. Раствор подвергают сушке вымораживанием, получают порошок желтого цвета. Твердый продукт промывают ацетоном для растворения избытка йодистого бария, центрируют и выделяют светло-желтый продукт, который сушат в вакууме. Выход 13 мг ( 3g(j 0,0004 мкг/мл). Пример 2. Фильтрат культуры (см. пример 1) дает зону диаметром 17 мм при определении бактерицидной активности при пробе на КЕеЪб еЕРа aei oget-res , зону диаметром 38 мм при пробе КЛ Л и величину JgQ при разбавлении 1:100000. Осветленный фильтрат культуры (17О л) мпературой 5°С переколируютв восходя- щем потоке через колонку диаметр ом 2 2,8 6 см заполненную до высоты 40,64 см активированным древесным углем Фарнелл ВО с частицами размером 6О-8О меш, предварительно промытого 1 н, соляной кислотой и эабуференного до рН 6 фосфатным буфером (скорость 800-10ОО мл/мин). Раствор промывают на денонизировавной водой (10 л) и элкжрУют 20%-ным ацетоном при температуре 20 С, Активные фракции (1О л) концентрируют выпаривание в вакууме при температуре ниже 30°С до объема 6 л и высушивают вымораживанием Получают 282 г сырого ММ 4550 (комплекс), 0gQ 0,05 мкг/мл. П р и м е р 3. Колонку диаметром 1см заполняют до высоты 6 см ионообменной смолой Дауэкс 21К (2О-50 мин по ста дарту США, хлоридная форма). Слой смолы промывают четырьмя порциями по 4,7 мл 5%-ного водного метанола, после чего промывают 4,7 мл воды { одной порцией). 2 л фильтрата культуры получают как в пр мере 1 и переносят в колонку. Затем смолу промывают 5О%-itbiM водным метанолом для удаления загрязнений. ММ 455О (комплекс) элюируют со смо лы 59о-ным раствором хлористого натрия в 50%-ном водном метаноле. Фракции № 2-5 содержат 6О% активно- но вещества. Общий сухой вес этих фракций 210 мг. Пример4. К 10л осветленного фильтрата культуры ( см. пример 1) прибавляют 248 г сульфата натрия. Полученный раствор экстрагируют 2%-ным раствором кислого сульфата тетра-н- утиламмони в дихлорметане (Ю л) путем перемешивания в течение 30 мин. Фазы разделяют ,и дихлорметановую фазу охлаждают до темпе ратуры . Небольшое количество суспендированной воды удаляют путем фильтрования через бумагу Ватман № /ЗР . |Ди; хлорметановый раствор концентрируют до .объема 20 мл выпариванием в вакууме при температуре ниже ЗО С. Смолу, содержащу комплекс, осаждают 4ОО мл петролейного эфира при температуре 40-60с. Смолу собирают фильтрованием, повтор- но растворяют в 50 мл дихлорметана и экстрагируют 50 мл воды, содержащей 1 г йодистого бария и 1 г карбоната бария, встряхивая в течение 2 мин. Водную фазу, содержащую комплекс ММ 4550 в форме бариевой соли, доводят до рН 6,5 и высушивают вымораживанием. Получают 317 мг сырого препарата ММ 455О (комплекс) с показателем Эл,0,001 мкг/мл. П р и м е р 5. Сьфой препарат ММ 4550 (комплекс), полученный по примеру 2, повторно растворяют в воде (12,5 г в 125 мл) и экстрагируют 125мл 10%-наго раствора кислого сульфата тетра-н-бутиламмония в дихлорметане. Фазы разделяют, и дихлорметановую фазу подвергают обратной экстракции при помощи 100 мл воды, содержащей 190 г йодистого натрия, при температуре 2 С путем медленного перемешивания и установления величины рН водной фазы 6,4 2%-ным раствором бикарбоната натрия. Раствор высушивают вымераживанием, и твердое вещество промывают ацетоном. Получают 88 м (70%) препарата смешанных солей ММ 4550 и ММ 139О2 с величиной Jgp 0,002 мкг/мл против /5-лактамазы Е S с h . с О 2 . Пример 6. 1г сырого ММ 4550 (комплекс), полученного по примеру 4, хроматографируют на сефадексе 6 , используя в качестве элюента смесь ацетон: вода (4:6). Элюирование проводят со скоростью 1,5 мл/мин, активные фракции обьединяют, концентрируют в вакууме при темпера- туре ниже 30 С и подвергают сушке вымо- раживанием. I Получают 22 мг (88%) аморфного твердого вещества каштанового цвета и величии ной ;3г« 0,005 мкг/мл, очистка 40;эократная. П р и м е р 7. ММ 455О (комплекс), полученный по примеру 5, хроматографируют :на колонке с целлюлозой (2,5 см х 32 см, Ватман СС 31) и элюируют смесью изопропанола с водой (7:3 об/об) со скоростью ,1,5 мл/мин. Бактерицидно-активные фракции объединяют, концентрируют в вакууме гфи температуре ниже ЗО С и сушат вымораж(шанием, Получают 40 мг коричневого |аморфного препарата комплекса антибиотиО,ОООО7 мкг/мл. ка с величиной Очень низшая величина 3 показывает. что активный материал обпадет повышен1НОЙ степенью чистоты. I П р и м е р 8. Фильтрат культуры (340 л), полученный по примеру 1, перколируют в восходящем потоке со скоростью 800-1200 мл/мин через колонку i( d 22,86 см, h 27,94 см), запол|ненну10 углем Фарнелл ВО. Колонку промывают 20 л воды и элюируют в нисходящем потоке смесью ацетона с водой (2:3 об/об) со скоростью 200-25О мл/мин. Собирают фракции объемом 1 л. { рлкцин, .содержащие ММ 455О (комплекс), определяют постановкой пробы KAQ-, объединяют (11 л) и концентрируют в вакууме при температуре ниже до объема 5,5 п. Кон центрат охлаждают до температуры , прибавляют 5,5 л (вес/объем) кислого сульфата тетра-н--бут1шаммонкя в дихлорметане с температурой - 5 С, и обе фазы перемешивают 2 мин. Дихлорметановую фазу отделяют и приба ляют к 1 л 0,8%-Hov o раствора нодида натрия при температуре О С. Обе фазы осторожно перемешивают, и величину оН Фазы постепенно доводят до 6,,0 2%. -нымВо ным. раствором бикарбоната натрия. Водную фазуотделяют и высушивают вымораживанием. Высушенный твердый продукт экстра. |гируют безводным ацетоном для растворения избытка иодиаа натрия, а ацетон удаляют из нерастворимого остатка в вакууме Получают 1,1 г порошка каштанового цвета. Степень очистки .кратцая. Колонку диаметром см заполняют порошкообразной целлголозой (Ватман СС31 в смеси изопропанола с водой (7:3) до выссугы слоя 32 см, 5ОО мг иорошха каштанового цвета растворя5от в 2 мя смеси изопропанола с водой (7:3) и хроматограф руют с применением того же растворителя при скорости эпюирования 1,5 мл/мин. Из колонки собирают фракции объемом по 3 мл, и те фракции, которые показьтЕагот характерные максимумы поглошеиия при длине волны 285 нм, обьецинягот, кокцент рируют и сушат вымораживанием для получения ММ 455О (комплекс). Получают 35 мг коричневого аморфно™ го веш.ества. которого О, О001 мкг/мл, степень очистки бОО -крат- ная. П р и м е р 9. Фильтрат культуры (1100 п) после ферментапии 6ts oSivaceu АТСС 31126 с величиной рН 6,5 и температурой 5°С перколируют со скоростью 3,3 л/мип через колонку (10,3 м X 1 м) из г ранулированного угля Колошсу промывают водой (6О л) и элюи руют смбсью ацетона с водой (2:8 об/об) при температуре 80 С со скоростью 1,1 л/мин. Собирают 60 л, а последние 5 фракций - по 10 л. Фракции (4Ол), содержащие ММ 4550 (комплекс), обьединягот и концентрируют в вакууме при темпер ниже ЗО-С до объема 32 л. Концентрат охлаждают до температуры 5 С, прибавляют 16 л 0,2%-ного раствора хлорида цетилдиметилбензиламмония в цихлорметане температурой 5 С и обе фазы перемешивают 5 мин . Дихлорметановую фазу отделяют и вно сят в 3,75 л раствора йодистого натрия (0,4%-ного) при температуре 5 С, Обе азы перемешивают 5 мин, водную фазу отделяют, сушат вымораживанием. Высушенный твердый продукт экстрагируют бегводным ацетоном для растворения избытка йодистого натрия, и остаточное твердое В(5- шество сушат в вакууме. Получают 2,87 г порошка рыжеватокоричневого цвета. Степень выделения комплекса на этой стадии 6%, степень очистки; 160-кратная. Колонку диаметром 63 мм заполняют . порошкообразной целлюлозой (ВатманСС31 у в смеси изопропанола с водой (7:3) до высоты слоя 300 мм. 2,0 г порошка рыже- вато-коричневого цвета растворяют в 5 мл смеси изопропанола с водой (7:3) и хроматргрфируют с той же системой растворителей со -скоростью 3 мл/мин. Фракции, содержащие jVW 4550 (комплекс), обьединятат, кошюнтрируют выпарива}шем в вакууме при температуре ниже ЗО-С и подвергают сушке вымораживанием. . Получают 207 мг твердого вещества коричневого цвета. Степень выделения на этой стадии 51%, степень очистки 5-кратная. Колонку диаметром 16 мм заполняют порошкообразной целлюлозой (ВатманССЗ) в смеси н-пропанола с водой (4:1) до высоты слоя 300 мм. 198 мг коричневого твердого вещества растворяют в смеси воды с н пропанолом (1:1) и хроматографиpsroT с системой растворителей н-пропанол- вода (4:1) со скоростью течения 0,5 мл/мин. Собирают фракции по 6 мл, проводят биоанализ против KSebsJe22a и снимают спектр поглощения каждой фракции в Ус)области, Фракции № 23-28 содержат двунатриевую, соль антибиотика ММ 13902. Эти фракции объединяют, концентрируют в вакууме и подвергают сушке вымораживанием. Получают 30 мг твердого продукта, Фракции содержат антибиотик ММ. 4550. Эти фракции объединяют, концентрируют в вакууме и сушат вымораживанием. Получают 53 мг твердого продукта, который содержит соль антибиотика IAIA 4450, загрязненную небольшим количеством соли антибиотика ММ 13902. Пример 10. Получение актибиотИ ка ММ 13902. Пробу спор 5tfi. о2 v.oiceu5 АТСС 31126 выдерживают в пробирках с сухой почвой в закрытом контейнере с агентом осушения при температуре . Небольшое количество про.бы почвы (20 мг) переносят в колбу Эрленмейера объемом 500 мл, содержащую среду следующего со-става .( в г/л): Моногидрат глюкозы20,0 Мука, из соевых бобовIQjO Деиояиаированная вода, л.До 1 Перед стерилизацией величину рН устагЕввливают 6,5. Колбу с содержимым подвергает инкубаяии в течение 30 час при температуре 28 С. 2 мл инокулята высевают на твердый агар-агар в колбе Ру. Состав агар-агаровой среды: Овощной сок У-3, мл 20 Агар-агар, г 20 Деиошзированная вода, л До 1 рН среды до стерилизации 6,0. Колбу с содержимым инкубируют при температуре ЗО с в течение 2 дней. Затем избыточную жидкость удаляют из колбы и инкубируют еще .4 суток, 50 мл деионизированной воды, содержа™ щей 0,02% Твина 80, вносят в культуру в колбе Ру, и споры суспендируют встряхи ванием. Суспензию спор вносят в 75 л среды в бродильном чане объемом 100 л. Состав среды (в г/л): Мука из соевых бобов10,0 Моногидрат глюкозы .20,0 Водопроводная вода, лДо 1 Для регулирования пенообразования к ферментационной среде до стерилизации при бавляют 50 мл 10°о--ного уроника LJS Среду стерипизуют водяным паром в броди ном чане в течение 20 мин- при температу 120 С, Культуру перемешивают со скоростью 140 об/мин и аэрируют стерильным воздухом со скоростью 75 л/мин. Температуру поддерживают на уровне 28 С, и после инкубации в течение 48 час содержимое чана прибавляют к 15ОО л сте рильной ферментационной среды в бродильном чане емкостью- 2ООО л. Состав ферментационной среды ( в г/л) Соевая мука10,0 Моногидрат глюкозы20,0 Мел0,2 Хлористый кобальт0,001 Сульфат натрия1,О Водопроводная вода, лДо 15 рН среды до стерилизации 6,0. Для предотвращения пенообразования в среду до стерилизации прибавляют 3 л 10%-ного Плуроника Ь81 в масле из соевых бобов. рН среды после стерилиза ,ции 7,О (устанавливают стерильным раст ром гидрата окиси натрия). Ферментационную среду перемешивают с скоростью 1Об об/мин, температура ферме Ггации ЗО С,, скорость аэрации , 200 л/м 28038 Продукт ферментации собирают через 0 час ;и осветляют центри|)угированием. ктивность 34О ед/мл. Фильтрат культуры (1050 л) температзфой 10 С и рН 8 экстрагируют дихлорметаном (810 л). Экстрагент содержит 1200 г хлорида цетвлдиметилбеваиламмоння. Фазы разделяют в центрифуге Шарплеса. Дихлорметановую фазу (13 СО л) подвергают обратной I экстракции водным раствором иодв- стого натрия (7 л воды и 21О г йодистого натрия). Фазы разделяют по весу. Величину рН устанавливают 7,0-7,7 соляной кислотой и фильтруют.I 7 л экстракта, содержащего йодистый натрий, с активностью 21900 ед/мл, пропускают через колонку, ёаполненную смолой сефадекс Q АЕ в фосфатном буфере (0,5 М), содержащем хлористый натрий (0,3 М), со скоростью 5О мл/мин при температуре 5 с. Колонку элюируют 0,7 М раствором хлористого натрия в 0,05М фосфатном буфере с рН и при температуре 5°С со скоростью элюирования 25 мл/мин. 2 л элюата отбрасывают и собирают 90 фракций. Фракции № 50.-62 объединяют, устанавливают рН 7, получают 1440 Мл антибиотика ММ 13902 с активностью 71000ед/мл. К объединенным фракциям прибавляют хлорпстый натрий (5 г/ЮО мл), и эту жидкость перколируют при температуре 5 С через колонку, заполненную смолой Амберлит , со скоростью 20 мл/мин. Антибиотик ММ 139О2 элюируют при комнатной температуре дистиллированной водой (2ОО мл), после чего элюируют водным 50%-ным метанолом, 1 л элюата выпаривают при температуре ниже 30 С при пониженном давлении до объема 70 мл, устанавливают рН 7 и сушат вымораж1№анием. Получают 1,62 г корич,невого твердого продукта, представляющего собой частично очищенную соль ММ 13 90 2 с активностью 3700 ед/мл. 1 г полученного продукта хроматогрфи- руют на колонке целлюлозы и элюируют смесью н-иропанола и воды (4:1) при скорости потока 2,5 мл/мин, 170 мл элюата отбрасывают и собирают 1ОО фракций по 15 мл. Фракции М- 37-43 (89 мл), содержащие двунатриевую соль ММ 13902, выпаривакгг при температуре ниже 30 при пониженном давлении для удаления н -пропанола и сушат вымораживанием, Получают 219 мт желтоватого порошка с активностью 73000 ед/мл. 11 Антибиотик MM NO 3902 представгшет собой твердую к рбоновую: кислтт. находящуюся в форме натриевой соян и имеющую следующие-эйрактерис-тикй; 1.Хорошо растворим в воде метаноле и нерастворим в хлороформе, диэтиловом ире и углеводородах 2.Максим5гм потагощениа в ультрафиолетовой области при длине волны 308 им при показателе 9ЕСТИНКЦИИ Ej 343.10 3.Максимумы поглошения в инфракрас. ной области при длине волны 3450. 2950, 1750, 1620, 1510, 1400 и 1260 см , 4.Обладает бактерицидной активностью JB отношении SlaphyPococcug auHeuS Boci -15 2us0ubt B49, со2(,К вЬЗ е2Ёа 5280 38 12 ,,ffie-ogeHeg,-Prdteug niiHobig 5,BaeniofieP а t iypliJ,Pseu(bwOHa0 aerugoио о. 5 Оказывает синергетическое вЬздейсг-вие в еочетанн-и с пениш-тллтшом и цефалоспоринами. Формула изобретения. Способ получения антибиотика кзт его сопей, отличающийся т-ем, что культуру5ii eptоitiусеS oSivaceuS АТСС 31126 выращивают в аэробных ус яовиях на среде, содержащей источники утперода и азота, минеральные соли, с поспе. дующим выделением антибиотического комппекса и разделением его на компоненты из- вестными приемами.
