Способ получения антибиотика, обладающего -лактамазной ингибирующей активностью Советский патент 1977 года по МПК C12D9/00 

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБИОТИКА, ОБЛАДАЮЩЕГО/ -ЛА1СТАМАЗНОЙ

ИНГИБИРУЮЩЕЙ АКТИВНОСТЬЮ

или же рост не гфоисходит вообще. Усваивает

1ЯНОЗИТ.

Крахмальный агар-агар после роста в течение 14 сут. образует воздзоиньш мицелий серо-коричневого цвета, субстратный мицелий оянвково-коричневого цвета, растворимый пигмеит не образует, мелаянн не образует.

Экстракт вфожжей агар-агар на экстракте солода, воздушный мицелий серо-коричневого иэета, субстратный ьшцелий олнвково-коричневого цвета, растворимого пигмента не образует.

Глвдерин аспарагиновый агар-агар: воздушный мицелий серого цвета, субстратный мицелий коричневого цвета, растворимого пигмента не образует.

Агар-агар на овсяной муке: воздушный мицеЛИЙ серого цвета, субстратный мицелий оливковокоричневого цвета, растворимый пигмент не образует.

Пример 1. Штамм Streptomyces olivaceus АТСС 31126 выращивают в течение 7 сут. при температуре28°С на слое твердого агар-агара в колбе Ру.

Агар-агаровая cpejEi имеет слещтощий состав, г/л:

Экстракт дрожжей10,0

Моногидрат гдюкозы10,0

Агар-агар15,0

Водопроводная водаДо 1 л

Величину рН среды устанавливают 6,8 до стерилизации. 50 мл стерильной деионизированной воды, содержащей 0,02 % твина 80 (моноолеат пояютиленсорбитана) прибавляют к культуре, находшцейся в колбе Ру, и споры суспендируют путем встряхивания. Эту суспензию спор прибавляют после этого в качестве инокулирующего вещества к 75 л стерилизованной среды для вызревания в бродильном чане из нержавеющей стали емкостью 100л. Состав среды для вызревания следующий, г/л:

мука из соевых бобов10,0

Моногидрат глюкозы20,0

Водопроводная водаДо 1 л

Для того, чтобы контролировать вспенивание, прибавляют 50 мл 10%-ного (об.) шщ)оншса L81 в масле из соевых бобов, и эту добавку вводят в ферментационную среду до стерилизации.

Среду стершноуют при номощи водяного пара в бродильном .чане в течение 20 мин при температуре . Культуру для вызревания перемешивают со скоростью 340 об/мин при помощи дисковой крыльчатой мешалки с диаметром 21,59 см и через 6а1Й(яер с открьггым концом вводят 150 л/мин воздуха.

Чан для культивирования снабжен отбойными перегородками. Температуру поддерживают 28° Си после инкубирования, проведенного в этих усло ВИЯХ, в течение 45 ч,«

7,5 л этой культуры вводят в качестве ниокулирующего вещества в 150 л стерильной сбраживаемой среды в бродильном чане и

нержавеющей стали емкостью 300 л. Среда для проведения ферментации имеет состав, г/л:

Мука из соевых бобов10,0

Моногидрат глюкозы20,0

Мел (осажденный карбонат

кальция)0,2

Хлористый кобальт

(гексагидрат хлорида

двухвалентного кобальта)0,01

Водопроводная водаДо 1 л

Для предотвращения вспенивания прибавляют ЗООмл 10%-ного плуроника L 81 в масле из соевых бобов. Полученный продукт собирают по прошествии 48 ч и осветляют путем центрифугирования. Осветленньш раствор дает 50 %-ное ингибирова1ше при пробе с энзимом при разбавлении 1:100000. 100 л осветленного раствора перемепшвают с 12кг (влажный вес) ионообменной целлюлозы Ватман ДЕ32 в ап/гтатной форме; этот материал представляет собой микрокристаллическую целлюлозу, замещенную диэтиламиноэтильными грунтами.

Шлам фильтруют и ММ 4550 (комплекс) элюируют с целлюлозой 12 л 0,5 М раствора сульфата калия. Экстракт концент{ 1руют до 6 л в вьшарном пленочном аппарате в вакууме при температуре ниже 30° С. Значительное количество сульфата калия переходит в осадок при прибавлении 12 л адатона. Раствор фильтруют и концентрируют до 200 мл путем вьшаривания в вакууме при температуре ниже 30° С. Концентрат загружают в колонку (76 мм X 2 м), заполненную смолш амберлит ХАД-4. Материал представляет собой неисшную полистирольную смолу и элюируют деионизнроваиной водой, собирая элюат фракциями по 140 мл. Активные фракции, обнаруживаемые испытанием по диффузии в агар-агаре, собирают вместе (2,2 л) и концентрируют до 275 мл путем ультрафильтрования с использованием мембраны ам/: он UM-0,5 (диаметром 150 мм). Концентрат noAaeprrtOT сущке вьшюраживанием для получе шя 2,2 г коричневого порошка. 1 г порошка растворяют в 1 л 0,2 М раствора сульфата натрия и смешивают с 1 л 2 %-ного (вес/объем) раствора кислого сульфата тетра н - бутиламмония в дихлорметане. Дихлорметано вую фазу отделяют по весу, охлаждают до-70° С, фильтруют для удаления льда и концентрируют путем вьшаривания до 20 мл. К концентрату прибавляют 400 мл петролейного эфира с т.кип. 4060° С и осадок отфильтровьшают, затем его повторно растворяют в 10 мл дихлорэтана и экстрагируют 10 мл воды, содержащей 80 мг иодистото бария и 70 мг карбоната бария. Фазы разделяют, водную фазу фильтруют и устанавливают рН6,5. Раствор подвергают сушке вымораживанием для получения желтого порошка. Твердый продукт промьтают ацетоном для растворения избьггочного йодистого бария и путем центрифугирования вьщеляют светло-желтый продукт, который йушат в вакууме. Выход 23 мг (1500,0004 мкг/мл).

Фильтрат культуры (1100л) после ферментации Streptomyces olivaceus АТСС 31126 с величиной рН 6,5 и температурой 5° С подвергают перкодяции со скоростью 3,2 л/мин через колонку (0,3 м х X 1м),заполненную гранулированным углем Царко. (Уголь регенируют перед употреблением промыванием его следующими реагентами: 0,5 н. раствором гидрата окиси натрия; смесью 0,2 н. раствора гидрата окиси натрия и ацетона 3:2; водой; 1 н.соляной кислотой; водой; фосфатным буферным раствором с рН 6; водой).

Колонку промьшают 60 л воды для вытеснения фильтрата культуры и элюируют объемной смесью ацетон: вода 2:8 при ЗОгС со скоростью 1,1 л/миа Собирают 60 л, а после них 5 фракций по 10л. Те фракции, которые содержат антибиотический комплекс, как это было установлено методом бактерицидной диффузии, с использованием Klebsielia aerogenes объединяют (40 л) и концешгрируют в вакууме при температуре ниже 30° С до объема 32 л. Степень рекупирации антибиотического комплекса на этой стадии бьша 15 %-ной.

Концентрат охлаждают до 5° С, прибавляют 16 л 0,2 %-ного раствора хлорида цетилдиметилбензиламмония в дихлорметане при 5° С и обе фазы перемешивают в течение 5 мин.

Дихлорметановую фазу отделяют и прибавляют к 3,75 л раствор 0,4 %-ного йодистого натрия при 5° С. Обе фазы перемешивают в течение 5 мин, водную фазу отделяют и подвергают сушке вымораживанием. Высушенный твердый продукт экстрагируют безводньпи ацетоном для растворения избытка йодистого натрия н остаточное твердое вешество сушат в вакууме дли получения порошка, окрашенного в рыжевато-коричневый цвет (2,87 г). Общая степень вьщеления антибиотического комплекса на этой стадии составляет 6%. Степень очистки, вычисленная из расчета на общее количество растворенных твердых веществ в фильтрате культуры, была равна 160-кратной.

Колонку диаметром 63 мм набивают порошкообразной целлюлозой в объемной смеси изопранол: вода 7:3 до высоты слоя 300мм; 2,0 г порошка рыжевато-коричневого цвета растворяют в 5 мл объемной смеси изопропанол : вода 7:3, и хроматографируют с той же системой растворителей со скоростью 3 мл/мин.

. фракции, содержащие антибиотический комплекс, что устанавливалось испытанием против Klebsielia aerogenes, объединяют, концентрируют путем выпаривания в при температ -ре ниже 30° С, подвергают сушке вымораживанием и получают 270 мг коричневого твердого вещества. Рекуперация комплекса на этой стадии была 51%-ной, а степень очистки пятикратной.

Колонку диамегром 16 мм набивают порошкообразной целлюлозой в объемной смеси н-пропанол: вода 4:1 до высоты слоя 300мм. 198мг коричневого твердого вещества растворяют в

объемной смесн вода: н-пропанол 1:1 ихроматографируют с объемной смесью н-пропанол: вода 4:1, со скоростью течения 0,5 мл/мин. Собирают фракции по 6 мл, производят би И1аштание против

Klebsielia aerogenes и снимают спектр погл Ш1ения каждой фракции в УФ-спектре. Фракции № № 23-28, показавщие максимум поглощения при длине волны около 305 нм, содержат двунатриевую соль антибиотика ММ 13902. Эти фракции объединяют,

концентрируют в вакууме и подвергают сушке вымораживанием для получения 30 мг твердого продукта. Этот препарат дает лишь одну зону бактерицидной активности щт величине Rf 0,77, измеренной методом тонкослойной хроматографии на

пластинках с целлюлозой, при применении объемной системы растворителей н-пропанол: вода а 4:1. Зону эту обнаруживают биоиспытанием против Bacillus subtilis (фракции №№29-40, показавшие максимум поглощения в УФ - области при длине

волны около 285 нм, содержат ММ 4550). Эти фракции объединяют, концентрируют в вакууме н сушат вымораживанием для получения 53 мг твердого продукта, который содержит соль ММ 4550, загрязненную небольшим количеством соли антибиотика ММ 13902.

Пример 2. Предпочитаемый способ выделения. Пробу cnop.S. olivaceus АТСС31126 выдерживают в условиях хранения проб сухой почвы в закрытом контейнере с агентом осушения при

20° С. Небольшое количество пробы почвы (примерно 20 мг) переносят асептическим способом в колбу Эрленмейера емкостью 500 мл, содержащую следующую среду, г/л:

Моногидрат глюкозы20,0

Мука из соевых бобов10,0

Деиогшзированная водаДо 1 л

Перед стерилизацией устанавливают рН 6,5. Мука из соевых бобов представляет собой продукт аркасой 50.

Колбу с содержимым подвергают инкубации во вращающейся кафшке (240 об/мин) в течение приблизительно 30 ч при 28° С. 2 мл полученного в результате роста продукта используют для инокулирования твердого агар-агара в склянке Ру.

Агар-агаровая среда имеет следующей состав: Овощной сок У-8, мл20,0

Агар-агар, г20,0

Деионизированная вода, лДо 1

До стерилизации устанавливают рН 6,0.

Инокулирующее вещество распределяют по поверхности агар-агара путем вращения склянки, которую после этого подвергают инкубации при 30 С. По прошествии двух дней ишсубацин, избыточную жидкость из колбы удаляют и инкубацию ведут еще

4 сут.

50 мл деионизированной воды, содержащей 0,02 % твина 80 вносят в культуру, в колбу РУ и споры суспендируют путем встряхивания. Эту суспензию спор прибавляют в качестве инскулируюше- ;

го вещества к 75л среды служащей для стадии

выращивания зародышей, в бродильном чане из нержавеющей стали евдасостью 100 л. Состав среды, применяемой на схадаи вьфащивания, г/л: Мука из соевых бобов

(арсасой 50)10,0

Мо1к гидрат глюкозы20,0

Водопроводная somДо 1 л.

Дя контролирования пенообразования к среде для ферментации прибавляют 50мл 10%-ного (объем/объем) алурошиса Z 8 в масле йэ соевых бобов до стертшизащш среды.

Среду подвергают стерилизации водяшлм паром в родаяьном чане в течение Ж)мнн прн 120° С. Культуру на этсш стадин перемешивают со скоростью 140 об/мин при помощи дисковой крьшьчатой мешалки с диаметром 19,05 см и в нее, через барботер с открытым концом подают стерильный воздух со скоростью 75 л/мин.

TeMnepaiypy поддерживают 28° С и после инкубавдш в этих условиях в течение 48 ч содержимое чана прибавляют в качестве инсжулирующего вещества к 1500л стерильной ферментационной среды в бродильном чан из нержавеющей стали емкостью 2000 л с отбойными перегородками. Фермешшщонная среда имеет состав,г/л:

Мука из соевь1х бобов

(аркасой 50)ЮЛ

Моногидрат глюкозы20,0

Мел (осажденный карбонат

калыщя)0,2

Хлористый кобальт (гексагидрат хлорида двухвалентного кобальта) 0,001 Сульфат натрия (безводный)1,0

Водопроводная водаДо 1500

До стерилизащш устанавливают рН 6,0 при помощи гидрата окиси натрия. До стерилизахдаи прибавляют 3л Ш%-ного плуроника L 81 в масле из соевых бобов для предотвращения пенообразования. После стерилизации устанавливают рН 7,0 при noMoiuji стерильного раствора гидрата окиси ватрия. Ферментационную среду перемешивают со скоростыо 106 об/мин при 30° с, а воздух пропускают со скоростью i 200 л/мин. Продукт ферментшдаи собирают по прошестаии 60 ч и осветляют путем центриф тирсва шя.

Полученный материал имеет активность в 340ед./мл. Разделение фракгдай осуществляют следующим образом.

Фильтрат культурь (1050 л, 340 ед/мл) с температурой 10° С и рН 8 экстрагаруют 310 л дихлор метаяа при 10° С; экстрагент содержит 1200 г хлорида детилдимепшаммония; обе жиддсости подаю насосами с установлешюй скоростью и пропускают через вмонгарованный в трубопровод смеситель. Фазы разделяют в центрифуге Шарплеса непрерьюкого действия, nepeNeuHiBaiffle в которой продолжают примерно 2 мин. Дихлорметановую фазу (300 л) подвергают обратной экстракции водным раствором йодистого натрия. Обратную экстракцию проводят четырехкратно, используя всего 7 я воды,

содержащей 210 г йодистого натрия. Фазы разделяют по весу. Величину рН водной фазы устанавливают 7,7 7,0 при помощи соляной кислоты и фильтруют.

Экстракт, содержащий 7 л йодистого натрия, имеет активность 21900 ед/мл.

Колонку ионообменной смолы готовят из сефадекса Q АЕ в 0,05 М фосфатном буферном растворе, содержащем 0,3 моля хлористого натрия; при опытах пользуются стеклянной трубкой диаметром 10 см; высота слоя 40 см. Экстракт (7 л), содержащий йодистый натрий при 5° С,перколируют через сефадекс Q АЕ со скоростью 50 мл/мин. Колонку злюируют 0,1 М раствором хлористся-о натрия в 0,05 М фосфатном буферном растворе с рН 7 также при 5° С, при скорости злюирования 25 мл/мин; 2 л злюата отбрасывают и собирают 90 фракций по 100 мл. Фракции сканируют в УФ-спектрофотометре и те же фракщи, которые показывают максимум поглощения при длине волны около 305 мм, объединяют и устанавливают рН 7 (фракции №N 50-62), объединенный объем 1440мл, активность 71000 ед/мл.

К объединенным фракциям прибавляют хлористый натрий (5 г/100 мл) и зту жидкость перколируют при 5° С через колонку диаметром 6,3 см, запо шениую смолой амберлита ХАД 4, уложенной слоем высотой 30 см, лри скорости пропускания 20 мл/мин. Антибиотики адсорбируются в этих условиях на смоле, в то время как неорганические примеси не адсорбируются. Антибиотики злюируют при комнатной температуре 200 мл дистиллированной воды, после чего проводят элюированиё водным 50%-ным метанолом. Элюат (1л) вьшарнвают до 70 мл при температуре ниже 30° С и пониженном давлении, устанавливаю рН 7 и сушат вымораживанием. Получают (2,18 г) коричневого твердого продукта, представляющего собой частично очищенную соль антибиотика ММ 45 50 с активностью 3100 ед/мг.

Частично очищенную двунатриевую cojib антибиотика ММ 4550 (0,55 г) подвергают хроматографической очистке на колонке целлюлозы (4,5 см 29см, целлюлоза Ватман СС31) и элюируют объемной смесью н-пропанол: вода - 4:1 при скорости потока 2,5 мл/мин. Первые 135 мл злюата отбрасывают и затем собирают фракции по 15мл. Фракщ{и, содержащие двунатриевую соль ММ 4550, что устанавливается методом поглощения в УФ-области, собирают (90 мл), выпаривают при температуре ниже 30° С при пониженном давлении для удаления н-пропанола и cyuiaT вымораживанием для получе1шя желтоватого порошка (87 мг), активность которого соответствует 6600 ед/мг.

Ангабиотик обладает максик{умом поглшцения в УФ-области при длине волны около 285 нм, при показателе экстинкции Е ° авком примерно240. Этот антибиотик дает спектры поглощения в ИК-области и ядерного магшпного резонанса. Результаты элементарного анализа этого материала

локазьшают, что он содержит азот, серу и натрий в соотношении: азот:сера:натрий 2:2:2. Позитивные и негативные максимумы кривых циркулярного дихроизма двунатриевой соли антибиотика ММ 4550 определяют на регистрирующем спектроВоляриметре Кзри-61 при концентрациях 037 мг/мл при длине пути 1 см; при зтом бьши получены, следующие результаты: X, нмДЕ/т

185+2,4x10207-1,22x10259-2,20 X 10290-1,89x10Предлагаемый способ обеспечивает получение достаточно Чистого антибиотика и его солей.

Антибиойпс представляет собой твердую карбоновую кислоту, находящуюся в форме чистой штриевой соли и имеющей следующие характеристики.

Он хо|юшо растворима в воде, метаноле и HepacTBofiHMa в хлороформе, диэтиловом эфире и углеводо зодах.

В водном растворе она показьшает характерный спектр поглощения в УФ-области, с максимумами поглоще1шя, один из которых находится при длине волны около 238 и 287 нм.

При введении ее в количестве 0,4 вес. % в свежеприготовленную таблетку бромистого калия она покйзьшает характерный спектр поглощения в ИЙС-области, который имеет максимумы поглощеШ1я в том числе при длине волны около 3450, 2950, 1765, 1695, 1510, 1390 и 1260 . При снятии спектра примерно через неделю после приготовления таблетки бромистого калия спектр показьшает Значительные изменения, например большой пик, Ьоо-Гветствующий максимуму при 1765 см , значительно уменьшается в размере или исчезает.

Она дает характерный спектр ЯМР, будучи раство|)енной в дейтерирова1шой воде (Да О). cheKtp которой показьшает в том числе (а) пару имеющих низкое поле дублетов с центром около 2,457 и 3,65т с константами связи около 15 Гц; (BJI дублет с центром примерно при 8,55т и (с) острый синглет примерно при 7,95.

Антибнотгик обладает бактерицидной активностью против различных видов, включая в том числе, штаммы. Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Escherichia coli, Klebsislla aerogenes, Proteus;mlrabHis, Acinetobacter anitratus, Serratia marcescens Snigella Sonnei.

Будучи смешанной с ампициллином он создает синергетическую активность против различных организмов, включая нттаммы Escherichia coli, Ktebsiella aerogenes, Proteus mirabilis, Proteus morganii u Staphyloeoccus aureus Русселя.

OH взаимодействует с реактивом Эряиха (300 мг 4-диметиламинобензальдегида в растворе 54 мл н- бутанола, 9 мл этанола и 9 мл концентрированной соляной кислоты) с развитием окраски.

10

Он не представляет собой общего яда для энзимов и не ингибирует следующие знзимы при концентрациях, превосходящих те, которые требуются для ингибирования бета-дактамазы Escherichia coli моноаминооксидазы, ангидразы угольной кислоты, декарбоксшшзы Допа, трипсина, химотр шсина или уреазы.

При проведении опытов методом тош ослойной хрснчатографии на-адсорбенте целлюлозе чистая двунатриевая соль антабиотика показывает следующие приблизительные величшоа Rf:

н-бутанол:изопропанол:вода 7:7:6 (об/об) 0,7 изопропанол:вода 7:3 (об/об)0,6

н-бутанал:этанол:вода 7:7:6 (об/об)0,7

н-пропанол:вода 4:1 (об/об)0,6

При проведении шыта методом тонкослойной хроматографии на силикагеле . динатриевая соль антибиотика показывает следующие приблизительные величины для Rf:

н-пропанол: 0,1 М фосфатньи буфер, рН 7-7,3 Rf 0,6 н-бутанол: метанол :в ода 4:1:2RF 0,34

В практически чистом виде динатриевая соль антибиотика имеет значения LSQ менее 0,0001 мг/мл, против jS-лактамазы Escherichia coli ЬИ.

Кроме того, антибиотик может быть охарактеризован как серусодержащий ингибитор лактамазы, производимый Streptomyces olivaceus АТСС31126 и в форме водного раствора динатрневой соли имеет максимум поглощения при длине волны около 238 нм и 287 нм.

Антибиотик и его соли имеют 90-100 %-ную степень чистоты.

Фармацевтические препараты, содержащие антибиотик или его соли,содержат в основном натриевую или калиевую соль антибиотика.

Такие препараты могут иметь форму, пригодную для орального, местного 1ши парзитерального применения. Можно использовать таблетки, капсуль,кремы, сиропы, перегруппированные порошки и стерильные препараты, пригодные для применения при инъекциях и в форме Ю1фузий.

Такие препараты могут содержать так5{се разбавители, связующие, красящие вещества, вкусовые и ароматные, консервирующие вещества, агенты дизентегрировакия.

Антабиотик может присутствовать в препаратах в качестве ед1шствеш1ого терапевтического агента или ОШ1 могут одновременно содержать антибиотик группы jj-лактама. К числу таких антибиотиков группБ Д-лактама относятся и те, которые являются чувствительными к (3-лактамазам и обладают устойчивостью по оп ошенкю к лактамазам. Такие антибиотики группы |3-j лактама включают ампициллин, амоксищшшш, бензилпе1шциллин, феноксиметилпенициллин, пропициллин, цефалоридин, цефокстин, цефалотин, цефалекс1П1, карбеницилдин, (тикарциллин, и п{дролизующиеся. in vivo сложные ЭФ1ФЫ зтих соединений,такие как феннловый, толиловый или индаюшовый сложные эфи- .

11

ры карбенициллина или тикарннллина или ацетоксиметиловый, пивалилснссиметиловый или фталиловый сложные эфиры ампициллина, бензшшенициллина, амсжощиллина,; цефал фидияа, цефлогшицниа.

Соотношение меязду антибиотиком или его солью и лактамовым анти огаком находится в интервале 10:1 - 1:10, нахфшвер в интервале 3:1 - 1:3. общее количество бакте ящидных агентов, присут твуюпщх в каждой едаявчисй дозирующей форме, находится в интервале 50-1500 мг и предпоч тительно между 100-1000 мг.

Рекомендуемые дозы можно вводить один раз в день шш несколько раз в день нащшмер от 2 до 4 раз в день при лечении таких заболеваний ак заболе12

зания мочевых и дьисательных путей, кожных болезней. Препараты можно применять при лечении бронхитов, гонорреи, отитов среднего уха, маститов.

Формула изобретения

Способ получения антибиотика, обладаняцего Э-лактамазной ингибирующей актнвностью, отличающийся тем, что щтамм Streptomyces olivaceus АТСС 31126 культивируют в аэробных условиях на среде, содержащей источники углерода, азота, серы и минеральные соли, из культуральной жидкости выделяют антибиотический комплекс, затем разделяют его хроматографическим путем и выделяют целевой продукт.