Способ получения рифамицина р, , и Советский патент 1977 года по МПК C12D9/00 

1

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается получения антибиотиков.

Предлагаемый антибиотик и способ его получения в патентной и научно-технической литературе не описан.

Целью изобретения является получение рифамицина Р, Q., 1 и t/ .

Это достигается тем, что штамм NQcardiatnediterraTteaATCC 31О64 (Д-2)или Mocardia тле(1й«ггапеа АТСС 31065 (ММ-18-6), или Nocardia mediterranea АТСС 31О66 (М-36 ) выращивают в аэробных условиях при температуре 25-37° С на питательной среде, содержащей источники углерода, азота И минеральные соли при рН 6,48,5, затем из ферментационной среды выделяют комплекс целевого продукта и разделяют его на отдельные компоненты Р, () , R и и .

Мутантные штаммы Nocardia niediUrronea АТСС 31О64 (),NQcardiu mediterranea ЛТСС31О65 (ММ-18-e) и Nocardia mcdi terrariea АГССЗЮбб (M-3G) получают обработкой АТСС зев 5 ааотис1Ч)й кислотойи производными нитрозогуанидинов в качестве мутагенных агентов или облучением рентгеновскими лучами или ультрафиолетовым светом.

Эти штамкл депонированы в коллекции АТСС и определены в качестве Wocof-Vcii а ittediteVt-анеаАТСС 31064-31066.

Культурально-морфологические признаки. Штамм АТСС 31 Об 4 (Д-2) - колонии конически-воронкообразные, закатанные, диаметр 2-3 мм, красновато-коричневые с охровым растворимым пигментом. Воздушный мицелий Слегка серовато-розовый, разветвленный диаметр 5,6-0,8 ммк. Споры цилиндрические 0,8-1 ммк.

Агар с овсяной мукой, обильный рост со слабо складчатой поверхностью, цвет лесного ореха с оранжевыми краями, розово-бежевый растворимый пигмент.

Глюкозо-аспарагиновый агар. Обильный рост с гладкой поверхностью, оранжевый, светло-желтый растворимый пигмент.

Глюкоаный агар по Эмерсону. Обильный рост с очень складчатой и покрытой корой

покерхпостью, кирпичногоцвета, янтарно- желтый растворимый пигмент.

Питательный агар. Умеретшгй агар с глакой и тонкой поверхностью, светло-оранжевый,

Лгар Придхэма. Умеренный рост с гладкой h тонкой поверхностью, янтарно-желтый, слабо розовато-оранжевый воздушный мицелий, розоватый растворимый пигмент.

Крахмальный,агар (среда № 4). Умеренный рост с гладкой поверхностью, оранжевы{ обильный воздушный мицелий, розовый, о5ильное образование спор, желтый растворимый пигмент, крахмальный гидролиз: отрицательный..

Физиолого-бкологические признаки. Гидролизует желатин, тирозин, казеин, малат кальнция, не гидролизует крахмал, нитраты. Лакмусовое молоко не коагулирует и не пектонизирует. Нитратную среду не восстанавливает. Усваивает арабинозу, ксилозу, глюкозу, манноззч фруктозу, лактозу, сахарозу, инозит, рамнозу, салицин, манннт, глицин, инулин, мальтозу, галактозу, глицерин.

Не усваивает раффинозу, сорбит, сукцинат натрия, цитрат натрия, ацетат натрия, дульцит, целлюлозу.

Штамм АТСС 31 Об5 (ММ-18-6) - это колонии конически - воронкообразные, закатанные, диаметр 2- 3 мм, глубокооранжевый с темно-оранжево-желтым растворимым пигментом. Воздушный мицелий розовый до светло-оранжевого, разветвленный, диаметр 0,6-0,8 ммк. Споры цилиндрические О,81 ммк.

Агар с овсяной мукой. Обильный JOCT с гладкой поверхностью, оранжевый, ро . зового воздушного мицелия, мало спор, розово-бежевый рас троримый пигмент.

Агар Чапека-ьДокса. Рост хороший с глад кой поверхностью, оранжевый, светло-оранжевый воздушный мицелкй.

Глюкозо-аспарагиновый агар. Очень слабый рост с гладкой поверхностью, светлооранжевый, нет растворимого пигмента, Глю- козный агар по Эмерсону, Обильный рост с очень складчатой и покрытой кЪрой поверхностью, кирпичного цвета, янтарно-желтый растворимый пигмент.

Питательный агар, умеренный рост со складчатой и тонкой поверхностью, светлооранжевый, нет растворимого пигмента.

Агар Придхэма, Обильный рост с гладкой поверхностью, кирпичного цвета, розовый водушный мицепий, желтый растворимый пигмент.

Крахмальный агар (среда № 4), Умеренный рост с гладкой поверхностью, глубокооранжевый, следы соломенно-желтого растворимого пигмента, крахмальный гидролиз: отрицательный.

Физиолопьбиологические признаки. Желатин гидропизует, нитратную среду не восстанавливает, лакмусовое молоко не коагулирует и не пектонизирует, крахмал малат кальция, нитраты не гидрилизует.

Усваивает арабинозу, ксилозу, глюкозу, машюзу, фруктозу, лактозу, сахарозу, рамнозу, раффинозу, маннит гдицин, инулин, мальтозу, галактозу, глицерин.

Не усваивает инозит, салицин, сукцинат натрия, цитрат натрия, ацетат натрия, дуцит, целлюлозу.

Культурально-морфологические признаки. Штамм АТСС 31 Об6 (М-36). Колонии конически-воронкообразные, закатанные, диаметр 2-3 мм, оранжево-коричневые с янтарно-желтым растворимым пигментом. Воздушный мицелий розовый до розово-оранжевого, разветвленный, диаметр 0,6-0,8 ммк, споры цилиндрические 0,8-1 ммк.

Агар с овсяной мукой обильный рост с гладкой поверхностью, темно-янтарно-желтый, следы розового воздушного мицелия, темно-янтарно-желтый растворимый пигмент, Агар Чапека-Докса. Обильный рост с гла кой поверхностью, оранжево-розовый, обильный воздушный мицелий, розово-оранжевый, следы светло-желтого растворимого пигмента.

Глюкозо-аспарагиновый агар. Очень хороший рост, золотистый, нет растворимого пигмента.

Глюкозный агар по Эмерсону, Обильный рост со складчатой поверхностью, темно-я тарно-желтый, темно-янтарно-желтый пигмент.

Питательный агар. Очень хороший рост с тонкой и гладкой поверхностью, оранжевый, нет растворимого пигмента.

Агар Придхэма, Обильный рост, слегка покрытый корой, янтарно-коричневый, следы розоватого воздушного мицелия, янтарно-коричневый растворимый пигмент.

Крахмальный аг;ар (среда № 4), Обильный рост с гладкой поверхностью, оранжевый, следы розового воздушного мицелия, светло-желтый растворимый пигмент, крахмальный гидролиз: отрицательный. Физиолого-биологические признаки. Желатин, казеин, тирозин гидропизует „ крахмал, малат кальция, 1штраты не гидролизует, нитратную среду не восстанавливает лакмусовое молоко не коагулирует и не пентонизирует.

Усваивает арабинозу, ксилозу, глюкозу, маннозу, фруктозу, лактооу, сахарозу, инозит, рамнозу, салицин, маннит, глицин, мальтозу, галактозу, глицерин. .Не ycBaireaeT раффинозу, сорбит, сукцина натрия, цитрат натрия, ацетат кагрия, инупи дуцит, цеплюпозу. Выращивают штаммы на питательной сре де, содержащей ассимилируемые источники углерода и азота до тех пор, пока в питательной среде не будет доказано наличие значительного количества рифамицина, после чего экстрагируют. Выращивание проводят при перемешивании и глубокой аэрации пита тельной среды при температуре 25-37 С (предпочтительно при 28°С). В качестве источников углерода применяют глюкозу, галакто, лактозу, сахарозу мальтозу, глицерин, маннит. Подходящими источниками азота являются, например, аминокислоты и их смеси, пектиды, протеины и их гидролизаты, например пептон, дрожжевой экстракт, мука соевых бобов, полученная вы мачиванием кукурузы в воде, рыбная мука, мясные экстракты и водные фракции из хлеб ных семян. Ферментация длится 18О-2ОО час, причем величина рН в начале 6,4-6,6. к концу повышается до 7,0-8,3. После окончания ферментации рнфамицййы выделяют следующим образом. Ферментационную среду отфильтровывают при рН 7,0-8,5, фильтрат быстро подкисляют (предпочтительно при величине рН ниже 5 для обеспечения стабильности антибиотиков). После этого их экстрагируют не смешивающимся с водой растворителем, например хлороформом, бутанолом, этилпропил-, бутил- или амилацетатом, причем объемное соотношение среды к растворителю в зависимости от растворителя составляет от 2:1 до 1О:1. Остающееся в мицепии количество антибиотиков экстрагируют не смешивающимся с водой растворителем и потом соединяют с орагнической фазой, содержащей главную долю рифамицинов, но можно также eKCl-papHровать смешивающимся сводои растворителем, например ацетоном. В этом случае жид кость отфильтровывают, а ацетон выпаривают в вакууме. После этого рифамицияы экстрагируют не смешивающимся с водой растворителем. После перевода антибиотиков в растворен ный вид выпаривают раствор в вакууме досуха предпочтительно при температуре ниже . Сырой экстракт рифамицинов очищают хро матографически на колонке силикагепя. Перед хроматографией растворяют экстракт в фосфатном фере при рН 7,О-8,О и затем обрабатывают слабым окислителем. Буферный раствор потом экстрагируют не смешивающимся с водой растворителем. : Экстракт содержит новый рифамицин R . Экстрагированный буферный раствор подкисляют до рН 2-4 и потом снова его экстрагируют указанным выше образом. Экстракт содержит новые рифамицины 5, Q R tJ . Дальнейшую очистку новых рифамицинов проводят хроматографическим путем на колонке, содержащей подходящий адсорбент, например сипикагель, с подходящей смесью растворителей в ачестве элюента. Пример 1. Мутантный щтамм N0cardJa mediterraTtea АТСС 81064 выращивают в течение 6-8 дней на агаре Беннета при температуре 28°С. Полученной скошенной культурой при стерильных условиях инкубируют две колбы Эрленмейера емкостью 50О мл, содержащие 10О мл гетативной среды следующего состава, г: Экстракт говядины5 Лрожжевой экстракт5 Пептон5 Гидролизат казеина3 Глюкоза20 NQCE1,5 ,о 1 л Величину рН при помощи раствора едкого натра доводят до 7;3. Копил в течекие 72 час выдерживают на качалке, после чего инкубируют предварительный возбудитель брожения емкостью Юл, содержащий 4 л указанной вегетативной среды. Затем выращива- . вне осуществляют при аэрашш, температуре 28°С и перемешивании при ЗОО об/мин. После 48 час получают 7-10% .плотно комплектованных, клеток. Затем используют тёкляннь1й бродильный резервуар емкостью Юл, содержащий 4 л ферментационной жидкости следующего состава, г: Арахисовая мука25 Мука из соевых бобов5 (NH),5 Mg-SO -THjO0,85 Глюкоза95 Глицерин4О КНгРОц1 Пропиленгликопь5 ,5 иэтилбарбитурат натрия1,7 CuSO SHafl2,8 FeSQ -ТНаО8,5 ZnSO -THzO42,5 МлбОц-«)НгО3,4 бНгО1,7 (НН)бМ070г„- НгО0,85 1 л Величину рН доводят до 7,8 при помощи аствора едкого натра. Затем стерилизуют О мин при температуре 12О°С, после чео рН доводят до 6|4 Для инкубации прцмвпяют количество прецваритепьного возбудителя броже1шя, соответствующее 5%-ному содержанию бродильного резервуара. Ферментацию проводят при температуре 28°С при аэрации с перемешиванием при 75О об/мин. В качестве антивспенивателя применяют силикон А. Культуральная жидкос в ходе ферментации приобретает характерный красно-бурый цвет. После 200 час получают определенный плотно уком плекгованных клеток. Если рН составляет 7,5, то культуру снимают. Пример 2, Культуру Nocafdia me diierranea АТСС 31064 получают, ка в примере 1, и выращивают в колбе на качалке. Для получения предварительной куль туры инкубируют стеклянный бродильный ре зервуар емкостью 10 л, содержащий 4 л с ды следукяцего состава, г: Глюкоза5 Арахисовая мука7,5 СаСОд1,65 Mg-SOV 7НгО0,33 КНгРОц0,33 FeSOnTHzO3,3 InSO THjO. 16,5 MnSOd HzO1,3 л Величину рН доводят до 7,5. Затем сте рилизуют в течение 5О мин при 12О°С, по ле чего величину рН доводят до 6,4. Посл 48 час плотно укомплектованные клетки со тавляют 6-8% общего объема. При помощи 10%-ного инокулума инкубируют стеклянны бродильный резервуар емкостью 2О л сод жащий ферментационную среду следующего состава, г: Кукурузная жидкость2О Мука из соевых бобов15 CNHh) Мд-$Оц-7Н200,85 Глюкоза1ОО СаСО FesOj, 1п50ц 7НгО (HjO CuSOi, 5HjQ CoCti 6HjO Ло 1 я . Величину рН доводят до 7,8 при помощи раствора едкого натра. После этого стерил зуют 50 мин при темпера: уре 12О°С, пос чего рН доводят до 6,4. Ферментация прох дит лри 28°С в течение 2ОО час. При рН 7,5 культуру снимают. Попуче}1иые по примерам 1 и 2ферментаи oiiibie жидкости счищают следующим образом. Мицепий отфильтровывают и выбрасывают, рН фильтрата доводят до 2,0 при помощи 10%-ной соляной кислоты и экстрагируют три раза, применяя одинаковое количество этилацетата. Органический экстракт выпаривают в вакууме досуха при температуре 35°С. Остаток (4 г из примера 1 и 11 г из примера 2) растворяют в 0,005 М буфере фосфата натрия при рН , после чего прибавляю NciN02 до конечной концентрации 0,2%. После перемещивания в течение ЗО мин при комнатной температуре экстрагируют буферный раствор три раза, применяя одинаковое количество этилацетата. Соединенные органические экстракты выпаривают в вакууме досуха при 35°С (первый экстракт этилацетат). рН отсосанного буферного раствора доводят до 2,-О при помощи 1О%-ной соляной кислоты и экстрагируют три раза, применяя одинаковое количество этилацетата. рбт единеншаш органические экстракты выпаоивают досуха при (второй экстракт этилацетата). Сухой порошок первого экстракта этилаце- тата (1,4 г из примера 1 и 4,2 г из примера 2) растворяют в хлороформе и хроматографируют на колонке силикагеля. В качестве первого главного продукта из колонки элюируют рифамицинК который можно узнать по оранжево-коричневому цвету. Согласно тонкослойной хроматограмме с пластинками силикагеля с хлороформом, метиловым спиртом в качестве системы растворителей (95:5) для рифамицина R ,,Rf 0,59. Фракции, содержащие рифамидин 1 , соединяют, выпаривают в вакууме досуха при 35°С, растворяют в этилацетате и промывают О, О1 н соляной кислотой и затем водой. Органический экстракт концентрируют и рифамицин R при температуре 4°С выкристаллизовывают из раствора (6ОО мг по примеру 1 и 1,6 г по примеру 2). Второй экстракт этилацетата хроматографируют на колонке силикагеля, как : и рифамицин 1. Сухой остаток (2,4 г по примеру 1 и 4,2 г по примеру 2) растворяют в хлороформе и наносят на колонку силикагеля. Колонку элюируют при помощи смеси хлороформа и метилового спирту (98:2). Снача- па получают рифамицин U , потом рифамицин К и рифамицин О, . Все три компонента являются желто-оранжевыми в промывном растворе и их можно определить тонкослойной хроматографией. Значения R составляют рафамицин U 0,63, рифамицин Р - 0,57, рис шмицин Q 0,32. Фракции, содержащие ри(})амииины Ц , Р и Q соединяют, выпаривают в вакууме досуха и кристаллизуют из этипацетата. По примеру 1 получают ВО г рифамииина U ,

4ОО мг рифамицина Р и 280 мг рифамицииа Ц , а по примеру 2 - 190, 90О и 75О мг.

При использовании штаммов Nocardia mediterrpnee. А1Х:С 31 Об 5 и 31066 получают аналогичные выходы рифамицинов U , Р и 6k ,

Формула изобретения

1. Способ получения рифамицина Р, 8л и. отличающийся тем,что штаммiNocardia maditt ranea АТСС 31064 {Д-2), или Nocardia meditterranea АТСС 31О65 {ММ-18-6), или NQCttrdia mediterronea АТСС 31О66 (М-36) выращЕшают в аэробных .условиях при текотера-

туре 25-37 С на питательной среде, содержат источники углерода, азота и минеральные сопи при рН 6,4-8,5, затем из ферментационной среды выделяют комплекс целевого продукта и разделяют его на отдельные компоненты Р, (i,, 1 и U .

2.Способ поп.1, отлич ающийс я тем, что, рифамицин выделяют из ферментационной среды экстракцией не смешивающимся с водой растворителем при рН ниже 5,

3.Способ по п. 1, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что комплекс целевого продукта разделяют на отдельные компоненты хроматографией на колонке.