Способ получения антибиотика, проявляющего активность в отношении -лактамазы Советский патент 1977 года по МПК C12D9/00 

Отделение антибиотика от неорганических солей, а также других загрязняющих веществ осуществляют посредством его адсорбирования на липофильную смолу, на которой не адсорбируются неорганические соли. Антибиотик удаляют из колонки элю ированием (водой или водным спиртом полученный раствор концентрируют вып риванием и сушкой с вымораживанием. Отделение антибиотика от неоргани ческих солей осуществляют также хро матографией на колонке, состоящей кэ гель-фильтрующего агента, например поперечно-сшитого декстранового геля например, Sepfiadex G -15 или пояиактиламидного геля, например, Biog-eE Р2. . Последующую очистку антибиотика можно осуществлять хроматографией на колонке на инертной твердой фазе (ей ликагель или целлюлоза), используя водно-спиртовые растворительные системы (вода-изопропанол, вода-н-пропанол, вода-метанол-иэопропанол, вод г-бутанол, вода-этанол-бутанол и другие). Предпочтительной является пропанол-вода 4:1 в сочетании с целлюлозным носителем. Фракции, которые показывают ультрафиолетовый спектр, характерный для антибиотика, обладают ультрафиолетовым максимумом поглощения приблизительно при 297 нм. Эти фракции собирают. Сушка с вымораживанием полученного раствора дает чистую соль антибиотика. П р им ер 1., Получение чистой соли антибиотика, Streptomyces otivaceus АТСС 31126 выращивают в течение 7 дней п температуре на пласте твердого агара в бутылке Рукса. Агаровая среда имеет следующий состав, г/л: Дрожжевой экстракт 10,0 Моногидрат глюкозы 10,0 Агар15,0 Водопроводная вода до 1 л Перед стерилизацией рН среды доводят до 6,8.50 мл стерильной деиони зованной воды, содержащей 0,02% твина-80, добавляют в одну бутылку Рукса и споры суспендируют встряхиванием. Эту споровую суспензию затем добавляют в качестве прививочного материала к 75мл стерилизованной среды для высевания в 100 л ферментато ре из нержавеющей стали. Состав среды для высевания еледуюШий, г/л: Мука соевых бобов 10,0 Моногидрат глюкозы 20,0 Водопроводная вода до 1л Для уменьшения вспенивания к ферментационной среде добавляют в масле соевых бобов 50 мл 10%-ного раствора Pturqnit L- 81 перед стерилизацией. Среду стерилизуют паром в ферментаторе в течение 20 мин при . Высеваемую культуру перемешивают при 140 об/мин мешалкой и подают стерильный воздух со скоростью 75 л/мин. Сосуд для выращивания снабжен отражательными перегородками. Температуру поддерзкивают 28с и после инкубирования при таких условиях в течение 45 час 7,5 л этой посевной культуры добавляют в качестве посевного материала к 150 л стерильной ферментационной среды в 300 л ферментаторе из нержавеющей стали. Ферментационная среда имеет следующий состав, г/л: Мука соевых бобов 10,0 Моногидрат глюкозы 20,0 Мел (осажденный карбонат кальция)0,2 Сульфат натрия10,0 Хлористый кобальт (CoClj. )0,001 Водопроводная вода До 1 л 300 .мл 10%-ного раствора Р игопГс в масле соевых бобов добавляют для предотвращения вспенивания. Ферментацию заканчивают через 48 час затем проводят центрифугирование. Очищенный бульон имеет активность 340 ед/мл. Очищенный бульон при 10°С и рН 6,8 экстрагируют дихлорметаном при температуре , содержащем хлорид цетилдиметилбензиламмония, посредством прокачки двух жидкостей с заранее определенными скоростями через линейный смеситель. Фазы разделяют на непрерывной центрифуге Шарплеза после дополнительного перемешивания в течение 2 мин. Дихлорметановую фазу экстрагируют водным йодистым натрием. Обратное экстрагирование осуществляют четырьмя загрузками, используя общее количество воды 7 л, в которой содержится 210 г йодистого натрия. Фазы отделяют при помощи гравитации. рН водной фазы доводят от 7,7 до 7,С с помощью соляной кислоты и отфильтровывают . Экстракт йодистого натрия содержит 21900 ед/мл. Ионообменную колонку подготавливают посредством набивки Q;A Septia dex А -25 в фосфатном буфере при рН 7, содержащем хлористый натрий, в стеклянную колонку диаметром 10 см до высоты 40 см. Экстракт йодистого натрия (7 л) при температуре пропускают через Q.AS Sepfiaden со скоростью 50 мл/мин. Колонку элюируют NaCf в ,05 М фосфатном буфере при рН 7 и емпературе 5С со скоростью 25 мл/мин л элюата выливают, а 90 фракций (100 мл) собирают. Фракции сканируют на ультрафиолетовом спектрофотометре и те, в которых наблюдают максимум поглощения приблизительно при 285 нм и которые являются смес антиСиоти-. ка и примеси, объединяют, а значение рН доводят до 7 (число фракций 25-35) объединенный объем 1230 мл при активности 8450 ед/мл. Хлористый натрий ( 5 г/100 мл) добавляют к объединенной фракции, которую затем пропускают при через колонку диаметром 6,3 см, набитую смо лой Ataberlite V ад-4 до высоты 30 см, при скорости потока 20 мл/мин. Антибиотик при этих условиях адсор бируется на смоле, а неорганические примеси не адсорбируются. Антибиотик злюируют при комнатной температуре /дистиллированной водой (200 мл), затем 50%-ным водным метанолом. Элюат (1 л) выпаривают при температуре ниже 30°С при пониженном давлении до 70 мл доводят рН до значения 7 и высушивают вымораживанием до коричневого твердого вещества (2,18 г) при активности 5000 ед/мг. Другая порция антибиотика немного чище и имеет активность 5700 ед/мл. Это твердое вещество хроматографируют на целлюлозной колонк, уравновешиваемой н-пропанолом-водой 4:1. Колонку элюируют, первые 135 мл элюата выливают, а:затем собирают 15-миллилитровые фракции. Эти фракции имеющие ультрафиолетовое поглощение, характерное для антибиотика, выпаривают при пониженном давлении, чтобы удалить н-пропанол, а затем высушивают вымораживанием, чтобы получить желтое твердое вещество. Это вещество согласно анализу, обладает активностью 1600 ед/мг. П р и м е р 2. Ферментацию и выделение проводят, как в примере 1 до стадии элюирования из Amberfite VAfl-4 включая ее. Элюат из колонки концентрируют при пониженном давлении цо объема 20 мл. Этот раствор вливают в колонку с Septiadex А-25 в О, IBM NaCt. Колонку элюируют сначала при экспоненциальном градиенте хлористого натрия от 0,18 до 0,28 М при полном объеме 2 л, затем элюируют при постоянном содержании хлористого натрия 0,28 М. Колонку элюируют при со скоростью 3 мл/мин и собирают 25 мл фракций. Фракции с ультрафиолетовым спектров поглощения, характерным для антибиотика, объединяют. Смешанные фракции выпаривают при пониженном давлении приблизительно до 10 мл и загружают в колонку 3,8x28 см из Biogf-ef Р2, уравновешиваемой в 1%-ном бутаноле. Колонку элюируют 1%-ным бутанолом со скоростью 2 мл/мин и собирают 5 мл фракции. Фракции с ультрафиолетовым спектром поглощения, характерным для антибиотика, и имеющие отрицательною ре:акцию на нитрат серебра при определении хлорида, смешивают. Смешанные фракции выпаривают в вакууме, чтобы удалить бутанол, и высушивают; вымораживанием, получают амфотерное твердое вещество. Твердое вещество растворяют в минимальном количестве н-пропаиол-вода (4:1) и разгоняют на целлюлозной колонке, уравновешенной в той же самой растворительной смеси. Колонку элюируют смесью н-пропанол-вода (4:1) со скоростью 1 мл/мин, при этом собирают 6 мл фракции. Фракции проверяют на ультрафиолетовое поглощение и те из них, которые имеют спектр, характерный для антибиотика, смешивают, выпаривают при пониженном давлении, чтобы удалить пропанол, и высушивают вымораживанием, получая светло-коричневое аморфное твердое вещество. Антибиотик является двухкислотным твердым веществом, которое в виде чистой двухнатриевой соли обладает характерным инфракрасным спектром, имеет характерный спектр ядерного магнитного резонанса, облетает характерным ультрафиолетовым спектром, который в воде имеет максимум поглощения около 297 нм. В чистом состоянии антибиотик в виде двунатриевой соли имеет значения RJ для тонкослойной хроматографии, приведенные в таблице. Элементарный анализ, проведенный на образце двунатриевой соли антибио тика, дает следующие результаты: С 31,9%; Н 4,2% N 5,4%; S 13,2%; NCI 11,6%. Антибиотик имеет мол,в. между 300 и 500. В чистом виде антибиотик в виде двунатриевой соли обладает хорошим уровнем антибактериальной активности против определенных грамположительных и грамотрицательных организмов, например против штаммов Bacittus subtitU, finterobacter tftoacae, ЙвйКеricJhia coli, Ktebstetla aerofenes , Proteus , mtrabUiS, Satmoaee a typKimurium , Serratia merce&cens , stapKy foeiiceu6 ciureut. В чистом виде антибиотик в виде двунатриевой соли способен к синерги стическому действию на антибактериальную активность р -лактамных антибиотиков (ампициллин и амоксицилли и против некоторых бактерий, включая определенные f-лактамазнопродуцируювще штаммы Staphytococcus и KUpsietta a-erofftnes. Двухосновньми солями антибиотика являются фармацевтически допустимые соли таких катионов, как натрия, ка лия, кальция, магния, алюминия, обы ного аммония или соли замещенного аммония. . Наиболее предпочтительно использовать фармацевтически допустимые соли щелочных металлов антибиотика, например двунатриевую соль или двукалиевую соль. Фармацевтические композиции, которые содержат антибиотик или его фар мацевтически допустимую ссшь, приме няют для борьбы с бактериальной инфекцией или для профилактики у млекопитающих, включая челотвека. Эти композиции используют для лечения з болеваний дыхательных путей, мочепо ловых путей, мягких тканей, кожи. Композиции могут иметь форму для орального, парентерального,внутриполостноо, инъекционного применения. Эти композиции обычно содержат от 10 мг до 5 г антибиотика или его соли, чаще всего содержат от 50 мг до 1,25 г соли антибиотика, например от 150 мг до 1,0 г. Композиции могут содержать антибиотик или его соль в виде единственного терапевтического агента, или могут содержать антибиотик или его соль вместе с другими терапевтическими агентами, например, с пенициллином или с цефалеспорином, такими, как ампициллин, амоксициллин, карбенициллин, бензилпенициллин, с гидролизуемыми irt vivo сложными эфирами вышеуказанных пенициллинов, с феноксиметилпенициллином, цефалоридином, цефалотином, фефалоглицином, цемандолом, цефазолином, с ацетонными или формальдегидными адцуктами любых из вышеуказанных пенициллинов или цефалоспоринов, которые содержат -амино группу в ациламино боковой цепи с клоксациллином, диклоксациллином, флуклосациллином или с другими известными -лактамными антибиотиками. Предлагаемый способ обеспечивает получениенового антибиотика, проявляюще о активность в отношении -лактамазы. Формула изобретения Способ получения антибиотика, проявляющего активность в отношении 3 -лактамазы, отличающийс я .тем, что, шатмм StreptoTnijuts otivaceus АТСС 31126 выращивают на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, с последующим выделением целевого продукта в виде свободной кислоты либо в виде ее солей.