Способ получения полипептидов Советский патент 1975 года по МПК C07K14/585 

1

Изобретение относится к области получения новых физиологически активных пептидов, являющихся аналогами природных гормонов.

Известен способ синтеза гипокальцемического гормона лосося - кальцитонина: Н-Цис-сер-асн-лей-сер-тре-цйс-вал-лей-гли-лиз-лей-сер-глн-глу-лей-гис-лиз-лей-глн-тре-тир-про-арг-тре-асн-тре-гли-

.-сер-гли-тре-про-, заключающийся в том,.

ifc

что указанный гормон синтезируют общеизвестными в химии пептидов приемами, например азидной конденсацией фрагментов: (1-9) + (10-16) +((17-23) + (2432). В ходе синтеза для защиты с -аминогруппы используют карбобензокси (Кбз) и трет. - бутоксикарбонильную (БОК) группы, БОК - группу для -аминогруппы лизина, нитрогруппу для гуанидинового азота аргинина, Кбз-группу для гидроксильндй группы тирозина и бензильную (Бз) группу для тиольной группы цистеина. Прочие функции не защищают.

В соответствии с предложенным изобретением описывается основанный на применении известных методов пептидной химии способ получения двух новых аналогов упомянутого каль цитЬнина с бц1е1Й рмулой: : :Н-Цис сер-асн-лей-сер-тре-цис-вал-лейс гли-лиз-лей-сер-глн-асп-лей-гис-лиз-лейглн-тре-фал-про-арг-тре-асн-тре-гли-Х-,-гли-У-про- NHa,

где X - остаток валина, а У - остаток аланина или X -остаток аланина, а У Q остаток валина

j или их кислотно-аддитивных солей или комплексов с тяжелыми металлами. Оба пептида получают по одинаковым схе- 1мам, предусматривающим создание необ, ходимой пептидной цепи конденсацией

соответствующих фрагментов, псчзходящим образом защищенных пептидных последова:тельностей, полученных ступенчатым син;Тезом. Для защитыСл-аминогруппы приме0 няют Кбз- и БОК - группы, для - ами;ногрупп лизинов - БОК - группу, Кбз.:группу для гуанидинового остатка аргинина |И трет. - бутиловый эфир (Обут) для -кар{боксильной группы аспарагиновой. кислоты.

Прочие функциональные группы не защищают. Конденсацшо фрагментов проводят с помощью дициклогексилкарбодиимида в прису(гствии |s|- оксисукцинимида, начиная с конца в той же последовательности, что и для упомянутого кальцитонина, причем фрагменты (1О-16), (17-23) и (2432) получают аэиднрй конденсацией (1012) + (13-16), (17-20) + (21-23) и . Ji24-28) + (29-32) соответственно. Возможно использование альтернативного спо- i соба получения фрагмента (17-32) из следующих блоков : (17-20) + (21-23) +(24)f k 2 5-2 8) + (29-32) с использованием тех же методов конденсации. После создания необходимой пептидной последовательности за1Ш1тные группы удаляют трифторуксусной кислотой.

Согласно настоящему изобретению воз: можно также применение других общеизвестных запштных групп и методов конденсации для получения целевых соединений.

Для получения кислотно-аддитивных солей предлагаемых соединений могут быть использованы органические кислоты: уксусная, молочная, янтарная, бензойная, салициловая, ; метансульфокислота, толуолсульфокислота, таннин, карбоксиметилцеллюлоза а также неорганические кислоты: соляная, серная, фосфорная. Под комплексом с тяжелыми металлами подразумеваются производные с кальцием, магнием, алюминием, кобальтом, в особенности с цинком.

В примерах температура указана в градусах Цельсия; величина (с) для оптического вращения составляет 1; сокращения применяют следующие: ,„карбобензилокси

L.(бензилоксикарбонил)

бал-бензил

БОК-трет.-бутилоксикарбонил

трт-тритил-трифенилметил

ОТБ-трет.-бутилокси

ОНФ-|2,иитрофенилокси

ОХФ-2,4,5-трихл.орфенилоксп

Оме-метокси

Оэт-этокси

МОа.-нитро

сер-{ -серил

асн-Ij -аспарагинил

асп-JJ -аспартил

лей- ,-лейцил

тре - JJ -треонил

вал - LJ -валил

арг - Lk -аргинил

глн - -глутам1шил

гис - L- -гистидил

про - , -пропил

гли - L/-глицил

ЛИЗ - ..-ЛИЗИЛ

фал - |,.-фенилаланил цис - jj-цистеинил ала - 1 -аланил

Осу-| -оксисукци.нимид

т.бут.-L-трет.-бутил

Получение исходного материала. Частичная последовательность Н-вал-глигала-про- NHj.

Суспендируют 27,5 г -вал глн-апа-про-NH 550 мл метанола и после прибавления 3 мл 96%-ной серной кислоты гидрируют в присутствии 4,1 мл ледяной уксусной кислоты и ЗД г 10%-ного палладия на угле. После фильтрации и выпаривания раствора продукт (сульфат) в тонкослойной хро.матограмме на силикагеле имеетК45- О,2.

Частичная последовательность А2Н-ала-гли-вал-про- NHj,.

1.2. -вaл-пpo-NHг.

Растворяют 75 г H-npo-NHjB 850 мл диметилформамида, прибавляют 312 г -валОХФ и затем раствор в течение 16час оставляют стоять при комнатной температуре.

После выпаривания в вакууме остаток пере:кристаллизовывается из сложного уксусного эфира. Получают 2 -вал-про- .пл. 13О131 - 41 в лиметилформамиде. 2.2. -гли-вал-про-ЫНг.1 Растворяют Н. -вал-про-NHjB 2200 мл метанола, прибавляют 85 мл 6 н. соляной кислоты в метаноле, гидрируют в присутствии палладия на угле при 20 и нормальном давлении, затем отфильтровывают от катализатора. Продукт выделяют простым эфиром, промывают и затем высущивают. 120 г полученного Н-вал-про-КН ЙС.пл. 217218°С; - 57 В метаноле) суспендируют

в 18ОО мл диметилформамида, прибавляют 196 Г2.-ГЛИ-ОХФ, затем 67 мл триэтиламина и в течение 17 час встряхивают при 2О . Вьщеленный гидрохлорид триэтиламина отфильтровывают и фильтрат

упаривают в вакууме. Остаток растворяют в смеси этилацетата и воды. После высуидивания. над сульфатом натрия и вьшаривания получают i -гли-вал-про-МШг.пл. 82 ( с разложением);

- 76 в метаноле.

3. .-ала-гли-вал-про-МН2« Растворяют 92 гХ-гли-вал-про-NHj в 2ООО мл метанола, прибавляют 27 мл 55 уксусной кислоты и гидрируют в присутствии палладия на угле при 2О и нормальном даачении. Фильтруют, выпаривают досуха в вакууме, остаток растворяют в 1000 мл диметилформамида, прибавляют 60 100 г Z-ала-ОХФ, встряхивают и в течение 17 час раствор оставляют стоять при 20 . Затем выпаривают в вакууме досуха и остаток кристаллизуют из этилацетата и эфира. Получают -ала-глй-вал про МН , т.пл, 80 (с разложением); ciLJjj - 31 в диметилформамидё.

4. Н-ала-гли-вал-про-МНг

Суспендируют 27,5 rZ -ала-гли-вал-про-ЯН 55О мл метанола и после прибавления 3 мл 96%-ной серной кислоты гидрируют в присутствии 4,1 мл ледяной уксусной кислоты и 3,1 г lOJii-Horo палладия на угле. После фильтрации и вьтаривания раствора продукт (сульфат) в тон кослойной хроматограмме на силикагеле имеетЯгц 0,4.

Система; хлороформ и метанол 7:3 О,5% воды,

Частичная последовательность 2 -тре-асн-тре-гли-ЯНЫНд. j Растворяют 98 г 2 -тре-асн-тре-гли;-оэт в 10ОО мл диметилформамида и при сбавляют 10О мл гидразин гидрата. После стояния в течение 16 час при комнатной температуре отфильтровывают и дополни;тельно промывают водой и простым эфиром. Получают указанное в заглавии сое т.пл. 221 °;CoL - 9 в диметил формамиде.

1 Частичная последовательность Ci : ;Н-арг-тре-асн-тре-гли-вал-гли-ала-про /Н2.

i Растворяют 13,5 г БОК-арг-тре-аснтре-гли ШШ 270 мл диметилформамида и воды (8:2), охлаждают до -15°, прибавляют 40 мл 4 и. раствора соляной кислоты в диоксане и 2,5 мл трет-бутилиитрита. Перемешивают в течение 1О мин при -15 , прибавляют 28 мл триэтиламина, отфильтровывают, прибавляют 1О,5 г Н-вал-гли-ала-про-Ш2{ частичная последо;в&тельностьД, перемешивйют в течение

;1б час прЬс О. Затем выпаривают досуха остаток промывают простым эфиром и высушивают. Остаток оставлйют в метаноле, прибавляют десятую часть объема воды и семикратное количество хлороформа и полученный раствор пропускают через копонку из 500 г силикагеля. После влюирования метанолом получают после выпаривани БОК-арг-тре-асн-тре-гли-вап-гли-апа-про4IHft-Последний суспендируют в 2ОО мп 4 раствора соляной кислоты в диоксане и в течение 2 час перемешивают при 25 Выпаривают досуха, остаток растворяют в 0,2 н, уксусной кислоте, обрабатывают амберлитом 41О {в виде ацетата) и водный раствор лиофилизуют. Затем остаток промывают простым эфиром, этилаце-

|ТаТОМ и опять простым эфиром и LlbiCyiniiвают над стружками гидроокиси натр), : Получают указанное в заглавии соединен .о

в виде диа 1етата; т.пл. 195 (с разлож: 1нием),Щ - - 64 в диметилфор1 {аг--,,де ;и 1 н.1Й{1:1).

Частичная последовательностьС

, . ll-clUi|- тре-асн-тре-гли-ала-гли-вал-про f j-jg , I Аналогично способу получения частичной последовательност Е7, пoлy aют из БОК-арг-тре-ася-тре-гли-ММЛ/НдИ Н-ала-гли-вaл-пpo N|yчастичная последовательHocTbAj) указанное в заглавии соединение в виде диацетата; т.пл. 155 ( с разложением), 38 в диметилформамидё

Частичная последовательность Сj: 2 -тре-асн-тре-гли-вал-гли-ала-про-ММй I К охлажденному до -15 раствору 11 г 12-тре-асн-тре-гли-МНМЦ((частичная поел 2-довательностьб) в 350 мл диметилформамида прибавляют 47 мл 1,85 н. раствора соляной кислоты в диоксане и 2,2 к.м трет.-бутипнитрита. Перемешивают F тече|ние 1О мин при -15 , охлаждают до -ЗО ,

прибавляют 12 мл триэтиламина и фильтруют в холодный раствор Н-вал-гли-ала|-прс -МНг(частичная последовательност1 Л{) в диметилформамвде. После 90 мин ; шивания при О сгущают в вакууме, JIJIHбавляют хлороформ и выделенный матери1ал отфильтровывают и высушивают. Раст:вор этого сьфого продукта в воде метано лефильтруют через дауэкс-50, доводят амберлитом до нейтрального

состояния и зате выпаривают в вакууме. Остаток растирают в ацетонитриле, нагревают, фильтруют и высушивают. Получают указанное в заглавии соединение- т.пл. 22Q с разложением),

- 28 в днметилформамиде. Частичная последоЕвтельность

. 2-тре-асн-тре-гли-ала гли-вал-про-Мй.,.

Аналогично способу получения частич НОЙ пocлeдoвaтeльнocт и Cj получакп- из

-тре-асн-тре-гли-ННННд| частичная последоватальностьБ1) и Н-ала-гли-вал-про-НН. (частичная последовательностьАг) указанное в заглавии соединение; т.пл.206 ( с разложением);

- 25° в диметилформамидё.

Частичная последовательность Сд . 2 а -йрг-тре-асн-тре-гли-вал-гли-ала-про - WHz. Растворяют 1О г2 -тре-асн тре-гли-вал-гли-ала-про-ЫН(частичная последовательность Q,) в 8ОО мл метанола - воды, ; 1рибавляют 0,5 г угля на палладии и пщрируют при нормальном давлении. Отфильтровывают от катализатора и выпаривают в ёакууме. Полученное масло Н-тре-асн-тре -гли-вал-гли-ала-про- NHg растворяют в 1ОО мл диметйлформамида, прибавляют 10 г2,-арг-Осу и в течение 16 час оста ляаот стоять при 2О . Затем раствор сгушают в вакууме, продукт вьщеляют с помощью ацетона и отфильтровывают. Остаток суспендируют вацетоне, нагревают до вскипания, фильтруют и высушивают. Получают указанное в заглавии соединени т.пл. 2О1 (с разложением);DDl.7jj - 15 в диметилформамиде. Частичная последова1ельность ( 3j -арг-тре-асн-тре-гли-ала-гли-вал-про Аналогично способу получения частичной последовательностиСдполучают изЕ-тр -асн-тре-гли-ала-гли-вал-про-| 2(частичная последовательностьСц) и.Е -арг-Осу указанное в заглавии соединение; т.пл. 18 (с разложением),1с1.2 - 14 в диметилформамиде. Частичная последовательность -гис-лиз- (БОК) -лей-глн-тре-фал-про-ОН. 1. Н-тре-фал-про-ОН. Растворяют 176 гН -фал-про-Оме в ЮОО мл метанола и(СС(1 гидрируют в присутствии палладия на угле при 2О и 1 атм И выпаривают. Остаток растворяют в 4ОО мл диметйлформамида, прибавЛ5ПОТ при О 100 мл триэтиламина, выкристаллизовавшийся гидрохлоид триэтилам на отфильтровьшают и к фильтрату приба ляют 2.-тре-Ш полученный из 87 г -трбМЙ Н путем растворения в ЮО мл 1 н. со ляной кислоты и прибавляют 35 мл 1 .н. нитрита натрия). Затем в-течение 16-час оставляют стоять при О , выпаривают дос ха, остаток растворяют в этилацетате, про мывают разбавленной соляной кислотой и затем разбавленным аммиаком, высушивают и выпаривают. Остаток пульверизируют в гептане, промывают петролейным эфиром и высушивают. Получают 2. -тре-фад-про Оме; т.пл. 92 (разложение) ,Mj - 16 в диметилформамиде. Растворяют 53 ri-тре-фал-про-Оме в 53О мл метанола, прибавляют 1ОО мл 2 н. натрового щелока, в течение 1 часа оставляют стоять при 25 , прибавляют 50 мл 2 н. соляной кислоты, концентрируют ДО- приблизительно 20О мл, прибавляют еще ЮО мл воды, устанавливают значение рН 10, водный раствор, промывают два раза этилацетатом, затем устанавливают значениерН 1 4 н, соляной кис лотой выделенный трипептид Н. -тре-фал-про-ОН экстрагируют этилацетатом, высушивают и выпаривают; т.пл. 1О5 f. -. с(.д 28 в диметилф :1рмамиде. Остаток растворяют в смеси 500 мл дисксана и ЮО мл воды и гидри5)уют в присутствии палладиёвого катализатора при 2О и под нормальным давлением. Фильтруют, выпаривают досуха, остаток промывают эфиром и высушивают. Получают Н-тре-фал-про-ОН; т.пл. 192 (с разложением); 41 в 95%-ной уксусной кислоте. 2. i ;-гис-лиз-(БОК)-лей-глн-тре-фал-про-ОН. Растворяют 40 г2 -гис-лиз(БОК)-лей-глн-МНЫКв 4ОО мл диметйлформамида, охлаждают до -2О , прибавляют 75 мл диоксана и .2 н. затем 6 мл трет.-бутилнитрита, перемешивают в течение 10 мин при -2О , прибавляют ЗО мл триэтиламкна и 20 г Н-тре-фал-про-ОН и в течение 16 час оставляют взаимодействовать. Затем выпаривают досуха, остаток промываю-;простым эфиром, разбавленной уксусной кислотой, простым эфиром, и, наконеп, горячим этилацетатом. Затем высушивают в высоком вакууме и получают.-гис-ииз{БОК)-лей-глн-тре-фал-про-ОН; т.пл. 200 .(разложение); - 47 в диметилформамиде. Частичная последовательность D 2 -гис-лиз-(БОК)-лей-глн-тре-фал-про- NHNH2 l.i-глн-тре-фал-про-Оме. 84,8 г -тре-(т.бут.)-Оме растворяют в 150О мл метанола и прибавляют 125 мл 2 н. соляной кислоты и 10 г 10%-ного палладия на угле. После гидрирования в течение 4 час отфильтровывают от катализатора и полностью выпаривают. .ei,2 г 1 -глн-ОН и 25,6 г N -oкc сукцинимида растворяют в ЮОО мл ацетонитрила и диметйлформамида и охлаждают до -15 . Сперва прибавляют раствор 45,7 г дициклогексилкарбодиимида в 200 мл ацетонитрила и затем растворяют пол ченный НСГ- Н тре-(т.бут)-Оме в диметилформамиде; при прибавлении 30,4 мл триэтиламина. При периодическом встряхиваНИИ оставляют стоять 16 час при комнат- ной температуре. Выкристаллизовавшийся гидрохлорид триэтиламина или дициклогексилмочевину отфильтровывают и фильтрат полностью выпаривают. Остаток растворяют в сложном уксусном эфире и промывают 1н. соляной кислоты и 5%-ным бикарбонатом натрия. После высушивания над сульфатом натрия органическую фазу сгушаюг до объема приблизительно- в 200 мл и прибавляют простой петролейный эфир. Выделенное масло растирают в порошок и отфильтровы9вают. Получают Z-глн-тре-(т.бут)-Оме; т.пл. ,-+il в диметилформа ,миде, 78,0 г 1 -глн-тре-{т,бут)-Оме растворяют в 800 мл метанола и прибавляют 65 мл гидрааингидрита. После 48 час вы держки при комнатной температуре раство полностью выпаривают. Остаток обрабатыв ют водой и затем перекристаллизовывают и метанола и воды. Получают Z -глн-тре:-{т.бут)-МН т.пл. 2О2°; irji ,-,0 L -Jjj- - 13 в метаноле.. 45,3 г Z. -фал-про-Оме растворяют в 750 мл метанола и прибавляют 55 мл 2н. соляной кислоты и 12 г 10%-ного палладия на угле. После гидрирования в течение 2 час раствор отфильтровывают от катализатора и фильтрат полностью вьтаривают. 49.5 г 7-глн-тре-(т.0ут)-МНМН2 растворяют в 500 мл диметилформамида и охлаждают до - 20 , прибавляют 77 м 5н. соляной кислоты в простом эфире и 13,4 мл трет.-бутилнитрита и продолжаю :перемешивать 10 мин и прибавлением 54 м триэтиламина доводят до нейтрального состояния. Полученный НС Н-фал-про-Оме растворяют в 150 мл дйметилформ- (амида, прибавляют 15,4 мл триэтиламин и все прибавляют к дипептидазиду. После перемешивания в течение 4 час при комн ной температуре отфильтровывают от вык ристаллизовавшегося гидрохлорида триэти i амина и фильтрат полностью выпаривают Остаток фильтруют при помощи хлороформ и метанола через колонку с силикагелем. После кристаллизации из этилацетата и петролейного эфира получают Ч -глн-треЧт.бут)-фал-про-Оме; т.пл. 110 , г .-jZOо LA-Jj 41 в метаноле. Тетрапептид растворяют в 250 мл трифторуксусной кисло- ы. После 2О мин стояния при комнатной температуре раст- вор сгущают до половины объема и продукт выделяют эфиром. Фильтруют и пром вают эфиром, получают после высушивания Z-глн-тре-фал-про-Оме; т.пл. 154 ; - 59 в метаноле, 2. Z -гис-лиа-(БОК)-лей- NH Мн,,, 114 г 2 -ЛИЗ(БОК)-ОН, 48 г Н-лейд.-Оме и 69 г N -оксисукцинимида растворяют в 60О мл этилацетата и охлаждают до -2О . К этому раствору прибавляют раствор 65 г дициклогексилкарбодиимидав ЗОО мл этилацетата. При периодическом встряхивании оставляют стоять в течение 16 час при комнатной температуре. Вык10ристаллизовавшуюся- дициклогексмлмочрвину отфильтровывают и фильтрат полностью выпаривают. Твердый остат(зк обрабатывают водой. После перекристалли;зации из этилацетата и петролейного эфира получают S -лиз-( БОК) -лей-Оме; т.пл. 113 ; Г в - 18° в метаноле. 101,5 S-ЛИЗ-(БОК)-лей-Оме растворяют в . ООО мл этилацетата и прибавляют предварительно охлажденный раствор 4О мл 5н. соляной кислоты в эфире и ЗОО мл сложного уксусного рфира. После прибавления 5 г 10%-ного палладия на угле в 50 мл диметдлформаМИДа гидрируют 31/2 часа. Затем отфильтровывают от катализатора и фильтрат выпаривают. 78,7 г 2 -гис-NH NH растворяют в 400 мл диметилформамида, прибавляют 182 мл 5п. соляной кислоты в простом эфире и охлаждают до - 10 . После пря;бавления 32,5 мл трет.-бутилнитрита продолжают перемешивать еще 10 млн и добавлением 140 мл триэтиламина доводят до нейтральной реакции. Полученный ранее НСгН-лиз(БОК)-лей-Оме растворяют в 300 мл диметил|формамида, прибавляют 36,4 мл триэтиламина и прибавляют все к раствору азида. После перемешивания в течение 4 час при комнатной температуре выкристаллизовавшийся гидрохлорид триэтиламина отфильтровывают и фильтрат полностью выпаривают. Получают масло, которое растворяют в этилацетате, органическую фазу промывают водой, высушивают над сульфатом натрия, фильтруют и сгущают. Затем продукт выделяют петролейным эф1|ром и отфильтровывают. Сырой продукт очищают путем хроматографии на силикагеле и элюирования хлороформом и метанолом. После кристаллизации из эфира и петролейного эфира получают -гис-лиз-(БОК)-лей-Оме; т.пл. 14в , - 28 в метаноле. 64,5 г г -гис-лиз-(БОК)-лей-Оме растворяют в ЗОО мл метанола и прибавляют 15 мл гидразингидрата. После 3 дней стояния при комнатной температуре раствор полностью выпаривают. К остатку прибавляют этилацетат и н-бутанол и несколько раз промывают насыщенным раствором хлорида натрия. Органическую фазу выпаривают досуха и остаток фильтрую-i через колонку силикагеля при помощи хлоргформа и метанола. Получают2. -гис-лиз(БОК) -лей-МНМНгТ.пл. 181°; МБ - 26° в метаноле.

11

3.2 (БОК)лей-глн-тре-фал-про-NHNHj..

38,4 г 2.-глн тре фал-про-Оме растворяют в 150О мл метанола и диметилформамиns j прибавляют 1О г 10%-ного палладия на угле в 50 мл воды, гидрируют 1/2 часа, катализатор отфильтровывают и фильтрат выпаривают.

38,6 г2)-гис-лиз(БОК)-лей-МНМН2 растворяют в 2 5О мл диметилформамида.

После охлаждения до - 15 прибавляют 42 мл 5н. соляной кислоты в эфире и 7,3 мл трет.-бутнлнитрита. Перемешивают 1О мин и доводят 29,5 мл триэтилак-шна до нейтрального состояния. Полученный ранее Н-глн-тре- мл-про-Оме растворяют в 250 мл диметилформамида и прибавляют в раствооу пептидазида. После неремешивання в течение 4 час при комнатной температуре выделившийся гидрохлорид триэч тяламина отфильтровывают и фильтрат полностью выпаривают. OcfiaTOK. растворяют 3 этилацетате и и -бутаноле и промывают 1 н. аммиаком, 1н. серной кислотой и несколько раз водой. Органическую фазу полностью выпаривают и остаток очи- щают пропусканием через колонку силикагеля при помощи хлороформа, метанола. и воды. Получают 5S-гиc-лиз(БOK)-лeйтлн-тpe-фaЛ Пpo-Oмe; т.пл. 171°; - 54 в метаноле.

43,6 г Z -гис-пиз(БОК)-лей-глн-тре-фал-про-Оме растворяют в 10ОО мл метанояа и диметнлформамида к прибавляют 44 мл гидразин гидрат 83. После 4 дней сточнил при комнатной температуре раствор полностью выпаривают. Остаток вываривают 3 ацетоиитриле. После охлаждения до приблизительно 2О от4 1льтровывают. Получают -гис-лиз-(БОК)-лей-глн-тре-фалnpo-ffH т.ш.

г J. fWг-г О

-.58 в метаноле. Частичная последовательность Е

1

Н-гис-лиз(БОК)-лей-глн-тре-фал-проарг-тр е-ас н-тре-гли &ал гли-ала-п ро-ПН

Метод А. Растворяют 10 г гептапепTHAia (частичная последовательность11|) в 10О лл диметилформамида, выпаривают, остаток растворяют в 1ОО мл диметилформамида, прибавляют 15 г Кксисукцинимида, охлаждают до О , прибавляют 5 г дицикпогексилкарбодиимида, 3 часа оставляют взаимодействовать, вьщелившуюся дициклогексилмочевину отфильтровывают, концентрит руют до 30 МП и полученный сложный гептапептидоксисукцинимидовый эфир -гис лиз( БОК )-лей-глн-тре-фап-про-Осу выде12

ляют прибавлением эфира. После промывания простым эфиром остаток растворяют в 1ОО мл диметилформамида, прибавляют 10 нонапептидамида {частичная последовательHOCTbCj) и в течение 16 час оставляют взаимодействовать. Прибавляют 5ОО мл этилацетата и фильтруют. Остаток растворяют в диметилвформамиде, прибавляют 10 мл уксусной кислоты и снова выделяют этилацетатом. Фильтруют, промывают этилацетатом и эфиром и высушивают. Получают Е-гис--лиз( БOK)-лeй ГЛн тpe-фaл-пpo apг-тpe-acн-тpe-гли-Ban-rnifrjana-npo- N Иг. 2. А 6 ОН eQ - - 24° (в диметилформамиде ), кото{ ый растворяют в 8О%-ной уксусной Кислоте. Затем прибавляют 5 г палладия на угле, гидрируют при нормальном давлении и комнатной температуре. Фильтруют, выпаривают в высоком вакууме досуха при 2О и остаток промывают эфиром. После высушивания над стружками КОН получают частичную последовательность Е, триацетат; т.пл. 185 (с разложением);

) - 42 В 1 Н. уксусной кислоте.

М е т о д Б. Растворяют 12 г нонапептида (частичная последовательность Сд) в 1000 мл диметилформамида и воды, прибавляют 1,8 г палладия на угле и гидри;руют при нормальном давлении. Отфильтровывают от катализатора и фильтрат сгущают в вакууме до 6О мл. Этот раствор Н-

-арг-тре-асн-тре-гли-вал-гли-ала-про- ЧН2 хранят при -2О .

К предварительно- охлажденному до -15 раствору 10 г i-гис-лиз(БОК)-лей глн-тре-фал-про- |ШН2 (частичная последовательностьВ2) 1ОО мл диметилформамида

прибавляют 21 мл 1,85 н. раствора соляной кислоты в диоксане и 1,1 мл трет.бутилнитрита. В течение 10 мин перемешивают при -15 , охлаждают до -30 , рибавляют 6 мл триэтиламина и фильтруют в холодный раствор Н-арг-тре-асн-тре-гли-вал.-гли-ала-про-4|1Н2 в диметилформамиде. После перемешивания а течение 9О мин при О раствор сгущают в вакууме, прибавляют

Хлороформ, осадок отфильтровывают, промы;вают хлороформом, затем этилацетатом и. .высушивают. Сырой продукт растворяют в смеси метанола, хпороформа и воды и наносят на колонку силикагеля. Элюируют, чистые фракции соединяют и выпаривают в вакууме

досуха. Остаток растворяют в метаноле, продукт выделяют этилацетатом, фильтруют и высушивают. Получают2, -гиc-лиз-(БOK)- -лей-глн тре-фал-про-арг тре-асн-.тре-гли-валг-гли-ала-про-МН т.пл. 185 (с разло жением);Мд . 2Q в диметилформамиде. 3,68 тюлученното таким образом гексадекапептида растворяют в 12О мл диме тилформамида и воды, прибавляю/т 3 г 10%-ного палладия на угле в 1О мл воды и подвергают-Латалитическому гидрировани Через приблизительно;;2 часа отфильтровывают от катализатора, фильтрат полностью выпаривают и получают частичную последовательность Jl,, Частичная последовательность Е Н-гис-лиз-( БОК)-лей-глн-тре -про-арг-тре-асн-тре-гли-ала-гли-вал про- WH. Метод В. Аналогично способу пол чения частичной последовательности Е (м тод А) получают из гептапептида (частич ная последовательность) и нонапептида (част11чная последовательностьСэ) частич- г ную последовательность :,, триацетат; т.пл 164 (с разложением); г 1 -120 оf , l.-J2) - 19 в диметилформамиде. М е т о д Г. Растворяют 30 г нонапе тида (частичная последовательность Cg) в 4 SO мл диметилформамида и воды, прибав ляют 3 г палладия на угле и гидрируют п нормальном давлении. Отфильтровывают от катализатора и фильтрат сгущают в вакуу до 25О мл. Этот раствор Н-арг-тре-асн-тре-гли-ала-гли-вал-про-Н1Ъсранят при -2 К предварительно охлажденному до -15 раствору 24 г 7 -гис - лиз ( БОК) -лей-глн-тре-фал-про- {H J Н2 (частичная последовательностьBg) в 200 мл диметил формамида прибавляют 52 мл 1,85н. раствора соляной кислоты в дноксане и 2,6 мл трет.-бутилнитрита. В течение 1О мин перемешивают при -15 , охлаждают до - 30 , прибавляют 14 мл триэтиламина и фильтруют в холодный раствор Н-арг-тре-асн-тре-гли-ала-гли-вал-npo-WH в диметилформамиде. После 2 перемешивания в течение 9О мин при О раствор сгущают в вакууме, прибавляют хл о, ро4юрм, осадок отфильтровывают, промывают хлороформом, затем этилацетатом и высушивают. Сырой- продукт растворяют в сме си метанола, хлороформа и воды и наносят на колонку силикагеля. Элюируют, чистые фракции соединяют и выпаривают в вакууме досуха. Остаток растворяют в к етаноле, продукт выделяют этилацетатом фильтруют и высушивают. Получают 2 -ги -лиз-( БОК)-лей-глн-тре-фал-про-арг-тре-асн-тре-гли-ала-гли-вал-про- NH2; т.пл. 180 (с разложением) - ЗО в диметилформамиде. t),75 получаемого таким образом гек- : садекапептида растворяют в 220 мл метанола и воды, гфибавлямт 6 г А 0Vi- iit4 (. палладия на угле в 20 мл воды и ini/iвергают каталитичес;кому гидрированию. После приблизительно 2 час отфнльтрс вывают от катализатора и фильт}1ат гголностью выпаривают. Получают частичную последовательность Е . Частичная последовательность F |тре-гли-лиз-(БОК)-лей сер-глн-асп-{ОТК)i-jiefl-NHNH2. 1. г-асп(ОТБ)-лей-Оме. Растворяют 151 г Z-асп(ОТБ)-ОН и 54 г W-оксисукцинимида в 7ОО мл ацетонитрила и охлаждают до - 20 . Затем прибавляют 96,5 г дициклогек-, силкарбодиимида, растворенного в 360 мл I ацетонитрила. После приблизительно I 30 мин стояния полученную дициклогексилмочевину отфильтровывают. К фильтрату прибавляют 71,2 г Н-лей-Оме, затем в течение 4 час оставляют стоять и выпаривают в вакууме. К твердому остатку прибавляют этилацетат и воду. Органическую фазу затем промывают 5%-ным раствором бикарбоната натрия, водой и разбавленной серной кислотой (), водой, высушивают над сульфатом натрия и выпаривают. Остаток растворяют в хлороформе, к которому прибавляют - метанола, и фильтруют через колонку силикагеля (10-кратное количество). Получают -асп-(ОТБ)-лей|-Оме; т.пл. 58 ; fXjjj - 16 в диметилформамиде. 2. 2.-глн-асп{ОТБ)-лей-Оме. Растворяют 118 г I -асп(ОТБ)-лейОме в 2000 мл метанола. Затем смешивают 15 г 1О%-ного палладия на активном угле в 63 мл 4н. соляной кислоты и прибавляют к раствору. Все подвергают :гидрированию в течение 2 час при комнатной температуре и нормальном давлении. При этом употребляют приблизительно 85% (от теоретического количества) водорода. Катализатор отфильтровывают и фильт рат полностью выпаривают, получают Н-асп(ОТБ)-лей-Оме. НС в виде аморф;ной пены. 91,7 г2-глн-ОНФ и 93,8 г Н-асп(ОТБ)-лей-ОмеНС растворяют в 500 мл диме- тилформамида и прибавляют 51 мл N -мбтилморфолина. В течение 15 час оставляют стоять при комнатной температуре и затем раствор полностью выпаривают в вакууме. Полученный таким образом остаток хорошо обрабатывают водой и отфильтровывают от воды. Затем перекристаллизовывают из метанола. Получают Z -глн-асп(ОТБ)-лей -Оме; т.пл. 189 (расзложение); л- -- - ..,.. - 30 в диметилформамиде.

15

3.X -сер-глн-аоп(ОТБ)-лей-Оме. Растворяют 44,4 г 1 гпн-асп-(ОТБ)

-лей-Оме в 1300 мл метанола и диметилформамида. Затем к 50 мл воды прибавляют 15 г 10%-ного палладия на ак- g .тивном угле и прибавляют к полученному раствору. После гидрирования в течение 2 час катализатор отфильтровывают и фильт рат выпаривают в вакууме.

, 21,4 X-сер- NH NHjj, растворенного Q

в 1Об мл диметилформамида, охлаждают до - 20 и прибавляют 5О,6 мл 5н. срляной кислоты в эфире и 10,3 мл трет,бутилнитрита. После перемешивания в течение 10 мин устанавливают-значение j5 рН-7,5 путем приливания 35,6 мл триэтиламина и прибавляют 34,2 г Н-глн- -асп-(ОТБ)-лей-Оме, растворенного в 1ОО мл диметилформамида. Перемешивают в течение 4 час при 20 , отфильтро- i2Q вывают от выделившегося гидрохлорида триэтиламина и фильтрат полностью выпаривают. После обработки остатка водой и последующей кристаллизации из воды и метанола сырой продукт очи- , g дают путем фильтрации через колонку сиикагеля при помощи хлороформа и метанола. Получают Z -сер-глн-асп-(ОТБ)-лей -Оме; т.пл. 172 -24 в дйметилформамиде.30

4.Тре-гли-лиз(БОК)-лей-NH NH. 50,8 г Z -ЛИЗ(БОК)-лей-Оме растворяют -в 600 мл сложного уксусного эфира и после прибавления 25 мл 4н. соляной кислоты Б простом эфире и 3 г 1О%-ного 35 палладия на угле подвергают каталиттескому гидрированию. Через приблизительно 4 часа отфильтровывают от катализатора и фильтрат сгущают до половины объема.

33,0 г тре-гли-ОН и 12,0 гМ-окси- 40 сукцинимида растворяют в 150 мл диметилформамида и охлаждают до -15 . К этому прибавляют раствор 21,6 г дициклогексилкарбодиимида в 1ОО мл ацетонитрила и смесь при периодическом встря- 45 хивании оставляют стоять в течение 3 час при комнатной температуре. Отфильтровывают от выкристаллизовавшейся дициклогексилмочевины и к фильтрату прибавляют при приливании 25 мл N -метилморфолина 50 полученный указанным гидрированием раствор дипептида. После стояния в течение 16 час полностью выпаривают. Остаток растворяют в этилацетате при О

обрабатывают 1н. серной кислотой и 5%-ным 65 раствором бикарбоната натрия. После высушивания над сульфатом натрия органическую фазу полностью выпаривают. Путем фильтрации полученной пены через жолонку силикагеля при помощи хлорофор- 60

16

ма и метанола получают тре-гли-лиз(БОК -лей-Оме Б виде аморфной пены;

10 в метаноле. . Остаток растворяют в ЗОО мг метанола, прибавляют 17 мл гидразингидрита ц в течение 16 час оставляют стоять при комнатной температуре. После полного выпаривания и дополнительного высущивания в высоком вакууме фильтруют при помощи хлороформа и метанола через колонку силикагеля., Путем кристаллизации из хлороформа и петролейного эфира получают тре-гли-лиз(БОК)-лей- VH Ян„;

.

т.пл.175°;&СЗ

20

-12 в метаноле.

5. Тре-гли- п;из( БОК)-лей-сер-глн-асп (OTБ)-лeй-NHNH

26,6 г I. -сер-глн-асп(ОТБ)-лей-Оме растворяют в 1 л метанола и диметилформамида, прибавляют 5 г 1Ь%-ного паллдия на угле в 1ОО мл воды и подвергают к.талитическому гидрированию. Через 1 час катализатор отфильтровывают и фильтрат сгущают.

29,6 г тре-гли-лиз(БОК)-лей-ЫНМН2 растворяют в 15О мл диметилформамида Охлаждают до - 20 и прибавляют 26,2 мл соляной кислоты в простом эфире и 5,3 м трет.-бутипнитрита. После перемешивания |В течение 10 мин прибавляют 18,5 мл триэтиламина и сгущенный раствор Н-сер-глн-асп(ОТБ)-лей-Оме. В течение 4 час пермешивают при комнатной температуре, затем отфильтровывают выделившийся гидрохлорид триэтиламина и фильтрат -полностью выпаривают. Остаток растворяют в эфире, перерабатывают в порошок и фильтруют на нутче. Сырой продукт очищают путем фильрации через колонку силикагеля при помощи хлороформа и метанола. тре-гли-лиз (БОК)-лей-сер-глн-асп.(ОТБ)-лей-Оме; т.пл. 217 ;Ид - 30 в метаноле.

Гептапептид растворяют в 4ОО мл метанола, прибавляют 1,4 мл гидpaзинги i ,рата и в течение 48 час перемещивают при комнатной температуре. Выделенный гидразид отфильтровывают, промывают простым эфиром и высушивают до постоянного веса; т.пл. 218°..{cCj - в дйметилформамиде.

Частичная последовательность G г тре-гли-лиз( БОК)-лей-сер-глн-асп-( . ГЬ) -лей-гис-лиз(БОК)-лей-глн-тре-фал- РОарг-тре-асн-тре-гли-вал-гли-ала-прО- МН 2СН СООН- .

О

2,43 г гептапептида (частичная последовательность Р ) растворяют в 30 мл диметилформамида. После охлаждения до - 2О прибавляют 1,45 мл 5н. соляной кислоты в эфире и 0,252 мл трет.бутилнитрита. В течение 10 мин продолжают перемешивать и затем доводят 1,01 м триэтиламина до нейтральной реакции. Гек садекапептид Е растворяют в 50 мл Диметилформамида и прибавляют к раствору, гептапептидазида. После перемешива в течение 4 час при комнатной температуре, выделенный гидрохлорид триэтиламин отфильтровывают и фильтрат полностью вы паривают. Остаток растворяют в небольшо количестве метанола и высаживают егоприбавлением простого эфира.; Сырой про- дукт хроматогра( на колонке силика геля и элюируют; хлороформом, метанолом и водой. Получают указанное в заглавии соединение; т,пл. 225 ; ffQjj - 18 в диметилформймиде. Частичная последовательность.Gg тре-гли-лиз-( БОК)-лей-сер-глн-асп- (ОТ Б) -л ей- гис-л из (БОК) -лей-глн-тре-фал-про-арг-тре-асн-тре-гли-ала-гли-вал-npo-NH2 2СНзСООНЗН2О. Аналогично способу получения частичной поеледовательностиб получают из геп тапептида (частичная последовательность и гексадекапептида (частичная последовательность ) указанное в заглавии соед HSHije; т.пл. 216 ; MB диметилформамиде. 11 р и м е р 1. Н-ЦЙс-сер-асн-лей-сё -тре-цйс-вал-лей-гли-лиз-лей-сер-глн-асп лей-гис-ЛИЗ-лей-глн-тре-фал-про-арг-тре- .acн-тpe-гли-вaл-гли-aлa-пpo-NH2 В ЗО мл 60%-ной уксусной кислоты растворяют 650 мг тре-гли-лиз(БОК)-лей сер-глн-асп (ОТБ); -лей-гис-лиз (БОК )-лей-глн-тре-фал-про-арг-тре-аси-трегли-вал-гли-ала-про- NH (частичная последовательность 6) ив течение 16 час оставляют стоять при комнатной температуре. После прибавления воды несколько раз промывают простым эфиром Водную фазу пропускают через колонку с амберлитом fC А-410(ацетат) и элюат упархивают досуха. Растворяют 295 мг БОК-цис-сер-аснлей-сер-тре-цис-вал-лей-ОН в 10 мл диметилсульфоксида и Диметилформамида, прибавляют 131 - оксисукцинимида и 59 мг дициклогексилкарбодиимида и через 6 час отфильтровывают от выделив шейся дициклогексилмочевины. Полученны Отщеплением тритильной группы трикоза- пептид растворяют в 1О мл диметилформамида и прибавляют к фильтрату. Через 48 час при комнатной температуре продукт выделяют прибавлением эфира. Оса}док переосаждают эфиром из метанола и полученные после высушивания 22О мг сырого заи№шенного дотриаконтапептнда растворяют в 4 мл смеси хлористого метилена, трифторуксусной кислоты it водь и через 1 час стояния при комнатной температуре упаривают досуха. Остаток растворяют в 0,2 н. уксусной кислоте, наносят на колонку (1хЗООсм) с биогелем д и элюируют 0,2н. уксусной кислотой. Соединенные чистые фракции выпа ривают и лиофилизуют. Получают указанное в заглавии соединение; т.пл. 215 (разложение); Cjp - 1н. уксусной кислоте. Соотношение аминокислот после кислотного гидролиза (6н.НСt ,16 час): асп 3,1; тре 3,7; сер 2,8; глн 1,9; про 2,0; гли 2,9; ала 1,0; цис 1, 2,0; лей 5,2; фал1,0; гис лиз 2,0; арг ,9; .. П р и м е р 2. Н-Пис ер-асн-лей ерГ -тре-цйс-вал-лей-гли-лиз-лей-сер-глн-асп-лей-гис-лиз-лей-глн-тре-фал-про-арг-тре-асн-тре-гли-ала-гли-вал-про- NN2 Получают аналогично примеру 1 из ЗОО мг тре-гли-лиз(БОК)-лей-сер-глн-асп (ОТБ)-лей-гис-лиз( БОК)-лей-глнтре - фал - про - арг - тре - ьсн - тре - глиала-гли-вал-про- NH,, (частичная последо- вательность Ли 17О мг БОК-цис-сер-асн-лей-сер-тре-цис-вал-лей-ОН; т.пл. 210 (разложение );И5 - 18 в 50%-ной уксусной кислоте. Соотношение аминокислот noc.rie кислотного гидролиза (бн.НС 16 час):асп 3,2; тре 3,9; сер 2,7; глн 2,0; 3,0; ала 1,0; иис 1,6; пли 5,0; фал 1,О; гис 1,О; лей арг 1,0. Формула изобретения Способ получения полипептидов обшей (jlbpмулы Н-ЦЙс-сер-асн-лей-сер-трё чйс-валлей-гли-лиз-лей-сер-глн-асп лей-гис-лизлей-глн-тре-фал-про-арг-тре-асн-тре-глиХ-гли-У-про-W Н ; где X - остаток валина, а У - остаток аланина или X - остаток аланина, а У остаток валина, или их кислотно-аддитивных солей или комплексов с тяжелыми металлами, отличающийся тем, что пептиды указанной формулы получают известными пептидными методами, например карбодиимидным, причем не участвующие в реакции свободные функциональные группы защищают промежуточно, в подходящей стадии синтеза образуют дпсульфидиый

19 . . 20

мсютик и переводят карбоксильную труп-лотами или в комп7гексы с тяжелыми Mf.

пу конечного пролильного х:татка в амид-таллами.

иую группу, а затем, если необходимо,; Приоритет по признакам; 29.10.70 при

полученные пептиды переводят известны-X - остаток валика, У - сютаток алгшнна;

ми приемами в их кислотно-аддитивные солиg 17.12.70 при X - остаток аланина,

с органическими или .Неорганическими кис -.У - остаток валина.

493OG1