Способ получения пептидов Советский патент 1988 года по МПК C07K7/06 A61K38/08 

ы

Изобретение относится к способу получения пептидов - новых биологи- чески активных соединений, которые могут найти применение в медицине,

Цель изобретения - получение новых пептидов, обладающих более высо- кой анальгетической активностью.

П р и м е р 1, Синтез СН -Тир- 1:Гли-Пли-Фен-Лей-Арг-СН Арг-Л-Лей- .

А. Растворяют в 200 мл тетрагид- рофурана 25 г БОК-В-Лей-ОИ-Н О.Раствор охлаждают до и добавляют

него 11 мл N-метилморфолина и

h

9,56 мл этилового эфира хлоруголь- |ной кислот 1. Через 5 мин добавляют в раствор 12,9 г 70 -ного водного раствора этиламина, и смесь перемешивают приблизительно при -5 С в те- чение 2 ч. После концентрирования остаток растворяют в этилацетате и промывают водным раствором гидрокарбоната натрия и водой последовательно. После концен- ирования досуха получа- ют 24,5 г БОК-Д-Лей-ШС Нд, Т.пЛ.ЮЗ- 106°С.

Тонкослойная хроматография (ТХС): значение Rf 0,77 (этилацетат). Оптическое вращение: (а).р +20,0 (, метанол).

Вычислено, %: С 60,44; Н 10,14; N 10,84. , C,.

Найдено, %: С 60,42; Н 10,33; N 10,86.

Б. Синтез г-СН5Арг(Тос)-Д-ЛейNHC HC. Растворяют в 15 мл тетрагидрофу;рана 1,43 г Z-CHjApr(Тос)-ОН, (а)д : -15, , диметилформамид, синтезированного из Н-Арг(Тос)-ОН. После охлаждения до -30°С в раствор добавляют 0,33 m N-метилМорфолина и 0,29 МП этилового эфира хлоруголь- ной кислоты. Через 5 мин в смесь до- .бавляют раствор 817 мг .H-Д- -Лeй-NHC, (синтезирован обработкой БОК-Д-Лей-ННС Нд трифторуксусной кис

лотой в присутствии анизола) и 0,83 мл триэтиламина в 7 мл тетрагидрофурана и смесь перемешивают приблизительно при -5°С в течение 2 ч. После концентрирования остаток растворяют в этил ацетате, промывают, водным раствором гидрокарбоната натрия и водой, последовательно и концентрируют досуха, получая 1,58 г стеклообразного Z- (Тос)-Д-Лей-ШС.гН5 .

,

5

0 5

0

.-

о ,

0

ТСХ: значение Rf 0,68 (метанол/ /хлороформ 1/7).

Вычислено, %: С 58,42; Н 7,19; N 13,63,

СзоН44 0 3

Найдено, %: С 58,29; Н 7,19; N 13,40.

В. Синтез БОК-Арг(Тос).(Тос)- -Д-Лей-МНС Н.

Растворяют в 4 мл диметилформами- да 1,1 г .Н,Арг(Тос)-Д-Лей-ШС,Н5, получе шого каталитическим восстановлением г-,СН.Арг(Тос)-Д-Лей-ШС.Н5 в пpиcvтcтвии катализатора Pd/C, 983мг .БОК-Арг(Тос)-ОН и 372 мг N-гидрокси- бензотриазола. В этот раствор при охлаждении льдом добавляют 520 мг дициклогексилкарбодиимида, и смесь перемешивают в холодильнике в течение суток и затем при комнатной температуре в течение суток. Полученные таким образом осадки отфильтровывают, а фильтрат концентрируют. Концентрированный остаток очищают с помощью хроматографии на колонке с силикаге- лем (элюент: смесь метанол/СНС 1/15), чтобы получить 1,2 г стеклообразного продукта БОК-Арг(Тос)-СНз- -Арг(Тос)-Д-Лей-ЫНС Н.

ТСХ: Rf 0,64 (метанол/хлороформ 1/7). Оптическое вращение:.(а)д -20,6(, метанол).

Вычислено, %: С 52,72; Н 7,30; N 15,37.

C oH64N,

Найдено, %: С 52,82; Н 7,22; N 15,06.

Г. Синтез БОК-Лей-Арг(Тос)-СН5Арг (Тос)-Д-Лей-ЫНС2Н5.

Растворяют в 12 мл диметилформами- да 1,645 г ВОК-Лей . Раствор охлаждают до и добавляют в него 0,726 ил N-метилморфолина и 0,631 мл этилового эфира хлоругольной кислоты. Через 5 мин k раствору добавляют раствор 4,986 г СР5СООН.Н-Арг(Тос)- (Тос)-Д-Лей-№1С,Е55, синтезированного путем обработки БОК-Арг (Тос)-СНзАрг.СТос)-Д-Лей-ШС2Н5 трифторуксусной кислотой в присутствии анизола, и 0,726 мл N-метилморфолина в 12 мл диметилформамида, и смесь перемешивают приблизительно при -5 с в течение 2 ч. После концентрирования и последующего отвердевания с помощью смеси метанол/эфир получают 5,283 г БОК-Лей-Арг(Тос)-CHj Apr(Toe)-Д-Лей- . Т.пл. 120-125 С (разложение).

ТСХ: Rf 0,66 (метанол/хлороформ 1/7). Оптическое вращение: (а). 25,8 (, метанол).

Вычислено, %: С 54,36; Н 7,67; N 14,84.

,,0,oS,,.

Найдено, %: С 54,49; Н 7,63; N 14,62.

Д. Синтез БОК-Фен-Лей-Арг(Тос)- (Тос)-Д-Лей-ШС,Н5.

Растворяют в 12 МП диметилформа- мида 1,465 г БОК-Фен-ОН. Раствор охлаждают до -З0 с и добавляют в него 0,608 мл Ы-метш1морфолина и 0,528 мл этилового эфира хлоругольной кислоты Через 5 мин в раствор добавляют 4,691 г .Н-Фен-Лей-АргСТос)- -CHjApr(Toc)-fl-neft-NHC H5, синтезированного обработкой БОК-Фен-Лей- -Арг(Тос)-СН,Арг(Т(с)-Д-Лей-рС Н5 трифторуксусной кислотой в присутствии анизола, и 0,608 мл N-метилморфо лина в 12 мл диметилформамида, и смесь перемешивают приблизительно при -5°С в течение 2 ч. После концентрирования остаток растворяют в этилацетате, и раствор промывают водным раствором гидрокарбоната натрия и водой последовательно. После концентрирования с последующим отвердеванием под действием смеси метанол/ /эфир получают 5,072 г БОК-Фен-Лей- -Арг{Тос)(Тос)-Д-Лей-ННС2Н5-. Т.пл. 127-132- С (разложение).

ТСХ: Rf 0,66 (метанол/хлороформ 1/7). Оптическое вращение: (a)jj -25,4 (, метанол).

Вычислено, %: С Н 7,48; N 14,18.

C55H64NiiO VSj СН,ОН.

Найдено, %: С 56,64; Н 7,33; N 13,86.

Е. Синтез БОК-СН,Тир(С1 Бзл)-Гли- -Гли-ОН.

Растворяют в 150 мл тетрагидрофу- рана 9,09 г БОК-СН Тир-(С1 Бзл)ОН, (а).р -49° (, этанол), синтезирован по способу С.Т.Чеунг и 2,53 г N- оксисукцинимида. После охлаждения льдом к раствору добавляют 4,12 г дициклогексилкарбодиимида, и смесь перемешивают в холодильнике в течени ночи. Полученные таким образом белые кристаллы отфильтровывают и к фильтрату добавляют 2,91 г Н-Гли-Гли-ОН и 38 мл водного раствора 1,848 г гидрокарбоната натрия. Смесь перемешивают при комнатной температуре в тече

0

5

0

5

0

5

Р

5

ние 2 суток и затем концентрируют. Разбавленный водный раствор лимонной кислоты и этилацетат добавляют к смеси и отделяют этилацетатный слой. После промывки водой с последующим концентрированием продукт очищают хроматографически на колонке с сили- кагелем элюируемой смесью метанол/ /хлороформ 1/30 и отверждают смесью эфир/н-гексан, получая 9,23 г БОК- -СНзТирСС Бзл)-Гли-Гли-ОН. Т.Ш1.70- (разложение).

ТСХ: значение Rf 0,79 (метанол/ /уксусная киспота/хлороформ 4/1/12). Оптическое вращение: (а) -17 (С- 1, метанол).

Вычислено, %: С 55,54; Н 5,99; N 6,94.

, N,0,С1 OjSCjHjOC Hs.

Найдено, %: С 55,45; Н 5,81; N 6,89.

Ж. Синтез БОК-СН-Тир(С12Бзл)-Гли- -Гли-Фен-Лей-Арг(Тос)-СН Apr(Toe)-Д- Лей-ШС Ну.

Растворяют в 4 мл диметилформамида 682 мл БОК-СН,Тир(С12Бзл)-Гли-Гли- -ОН и 195 мг N-гидроксибензстриазола. При охлаждении этого раствора льдом в него добавляют 272 мг дициклогексилкарбодиимида . После перемешивания в течение 2 ч в раствор добавляют раствор 1,167 г CF,COOH.H-Фeн-Лeй- -Apг(Toc)(Toc)-Д-Лeй-NHCJHy, синтезированного путем обработки БОК-Фен-Лей-Арг(Тос)СНзАрг(Тос)-Д- -Лей-ШС.Н. трифторуксусной кислотой в присутствии анизола, и 0,132 мл N- метиЛморфолина в 8 мл диметилформамида, и смесь перемешивают в холодильнике в течение ночи. Образовавшийся таким образом осадок отфильтровывают, и фильтрат концентрируют и очищают хроматографически на колонке с сили- кагелем (элюент: метанол/хлороформ 1/20). После отвердевания смесью метанол/эфир получают 1,391 г БОК- -CHJTиp-()-Гли-Гли-Фeн-Лeй- Арг(Тос)-СНзАрг(Тос)-Д-Лей-МНС Н5.. Т.пл. 130-135 С (разложение).

ТСХ: значение Rf 0,64 (метанол/ /хлороформ 1/7). Оптическое вращение: (а).р -35,3 (, метанол).

Вычислено, %: С 55,92; Н 6,77; N 12,70.

CT6««..,-CH,

Найдено, %: С 55,06; Н 6,49; N 12,52.

S143

3. Синтез СН Тир-Гли-Гли-Фен-Лей-Арг-СН Арг-Д-Лей-ШС Нр,

Растворяют, в 10 мл фтористого водорода в присутствии 0,2 мл анизола в герметичном для HF реакционном сосуде при -5°С 220. мг БОК-СН Тир (ICl Взл)-Гли-Гли-Фен-Лей-Арг (Тос)- -|СНзАрг(Тос)-Д-Лей-ШС Н5. Раствор п1еремешивают в течение 1 ч и затем HiF отгоняют из реакционной смеси. Остаток промывают эфиром и растворяют в воде. Раствор обрабатывают ионо- с бменной смолой Амберлит 1РА-93 (укС 52,73; Н 7,50;

Вычислено, %: N15,37,

СггН4оНбОб81„.Н,,0

Найдено, %; С 52,77; Н 7,60; N 15,14.

Б. Синтез (Тос)-Д-Лей- Apr(Toc)-NH.

Растворяют в 30 мл тетрагидрофура- на 3,336 г г-СНзАрг(Тос)-ОН. Раствор охлаждают до -20 С и добавляют в него 0,77 мл N-метилморфолина и 0,67 мл этилового эфира хлоругольной кислоты. Через 5 мин к смеси добавляют раствор

Изобретение касается пептидов, в частности способа получения пептидов общей формулы: R,Rj-L-Tyr-A-Gly- B-C-D-E-F, где R, R Н или R т э R,: Н и С,-С4-алкш1, А Gly; D-Cys, связанный с С, если С Cys; В Phe или (n-N05)Phe; С ;Leu, Met(O), Cys, связанный с А, если А D-Cys; D Arg, CH,-Arg, Lys; E Arg, CHj- Arg; F NH, D-Leu-X (при X OH, NH, OCjHy, ,.) или D-Leu-Arg-X . (при X NH, ), обладающих анальгетической активностью, что может быть использовано в медицине. Цель - создание новых более активных веществ указанного класса. Синтез ведут фрагментарной конденсацией мето- .дом постепенного наращивания пептидной цепи, исходя из БОС защищенной С - конечной аминокислоты, с использованием для активации карбоксильных групп карбодиимидного метода и метода смешанных ангидридов. В случае необходимости от полученного защищенного пептида отщепляют имеющиеся защитные группы. Новые пептиды обладают анальгетической активностью при эффективной дозе ЕДуо 0,22-,5 мг/кг (внутривенно) и 0,32-1,5 мг/кг (подкожно), против 25 мг/кг для динор- фина, при токсичности 20 - 100 мг/кг. 6 табл. ш 43 С«9 сд

ауснокислый тип) и высушивают вымора- 15 3,882 г CF COOH Н-Д-Лей-Арг(Toc)-NH,

живанием. Полученный таким образом неочищенный пептид (120 мг) очищают методом жидкостной хроматографии высокого разрешения (фаза Нуклеосил 5с 18, диаметр колонки 2, длина 25 см, элюент 0,1% НС1 в растворе воды: ацетонитрила 81:91)-и затем сушат вымораживанием, чтобы получить 70 мг СН Тир-Гли-Гли-Фен-Лей-Арг-СН,- -Арг-Д-Лей-ННС Н у.

ТСХ: значение Rf 0,70 (бутанол/ ./уксусная кислота/пиридин/вода 15/5/5/8).Оптическое вращение: Са)., -21,8° (,4, 0,01 н. НС1). acc-cпeктp (FAB) : 1036 (М+Н). Аминокислотный анализ: Гли 1,87 (2); Лей 1,96 (2); Фен 1,00 (1); Apr 0,95 (1) (пшси, соответствующие CHj и , не обсчитаны). : П р и и е р 2. Синтез Тир-ДЧ нс- 1 ли-Фен-Цис-Арг-СН5Арг-Д-Лей-Арг-Ш,

А. Растворяют в 10 мл диметилфор- Мамида 2,493 г БОК-Д-Лей-ОН-Н О. Раст- Яор охлаждают до и добавляют в него 1,1 мл Н-метилморфолина и 0,96 МП этилового эфира хлоругольной кислоты. Через 5 мин в смесь добавля- Й)т раствбр 4,414 г CFjCOOH.H-Apr(Toc)- Н и 1,65 мл N-метилморфолина в 20 мл

синтезированного путем обработки БОК- Д-Лей-Apr(Toc)-NH трифторуксусной кислотой в присутствии анизола, и 1,17 мл триэтиламина в 30 мл тетра- 2Q гидрофурана, и смесь перемешивают приблизительно при -5 С в течение .2 ч. После концентрирования с последующим отверждением смесью метанол/ /вода получают 6,14 г 2-СИзАрг(Тос)- 25 Д-Лей-Ар г (Тос)-Ш,. Т.пл. 100-113° С (разложение).

ТСХ: Rf 0,44 (метанол/хлороформ 1/7), Оптическое вращение: (а) -3,4° (, метанол).

Вычислено, %: С 54,18; Н 6,71; N 15,04,

C4iH58N,oO,Sj CH ОН

Найдено, %: С 54,12; Н 6, б2; N 14,85.

В. Синтез БрК-Арг(Тос)-СНдЛрг(Тос)- Д-Лей-Арг(Тос) -Ш,г.

Растворяют в 17 мл диметилформами- да 4,734 г СН Арг(Тос)-Д-Лей-Арг(Тос)- -NHj, полученного каталитическим .вос- Q становлением (Тос)-Д-Лей- -Арг{Тос)-Ш в присутствии Pd/C, 2,918 г БОК-Арг(Тос)ОН и 1,1 N-гидро- ксибензотриазола. К этому раствору при охлаждении льдом добавляют 1,543 г

30

диметилформамида и смесь перемешива- дс дициклогексилкарбодиимида, и смесь

- ft

ют приблизительно при -5 С в течение 2 ч. После концентрирования остаток растворяют в этилацетате и последовательно промывают раствором гидрокарбоната натрия и водой. После концентрирования к остатку добавляют Эфир, чтобы вызвать затвердение про- йукта. Таким образом получают 4,96 г БОК-Д-Лей-Арг(Тос)-Ш2. Т.пл. 110 - 120 С (разложение),

ТСХ: Rf 0,49 (метанол/хлороформ 1/7). Оптическое вращение: (а).р: р +13,0 (, метанол).

50

перемешивают в холодильнике в течение суток и затем при комнатной температуре в течение суток. Образовавшийся таким образом осадок отфильтровывают и фильтрат концентрируют. Остаток очищают хроматографически на колонке с силикагелем (элюент: смесь метанол/ /хлороформ 1/15) и отверждают эфиром, получая 4,917 г БОК-Арг(Тос)- gg -СН,Арг(Тос)-Д-Лей-Арг(Тос)-МН,. Т.пл. 131-13б с (разложение).

ТСХ: Rf 0,44 (метанол/хлорофорй 1/7). Оптическое вращение: (a)j, -16,7° (, метанол).

синтезированного путем обработки БОК- Д-Лей-Apr(Toc)-NH трифторуксусной кислотой в присутствии анизола, и 1,17 мл триэтиламина в 30 мл тетра- Q гидрофурана, и смесь перемешивают приблизительно при -5 С в течение .2 ч. После концентрирования с последующим отверждением смесью метанол/ /вода получают 6,14 г 2-СИзАрг(Тос)- 5 Д-Лей-Ар г (Тос)-Ш,. Т.пл. 100-113° С (разложение).

ТСХ: Rf 0,44 (метанол/хлороформ 1/7), Оптическое вращение: (а) -3,4° (, метанол).

Вычислено, %: С 54,18; Н 6,71; N 15,04,

C4iH58N,oO,Sj CH ОН

Найдено, %: С 54,12; Н 6, б2; N 14,85.

В. Синтез БрК-Арг(Тос)-СНдЛрг(Тос)- Д-Лей-Арг(Тос) -Ш,г.

Растворяют в 17 мл диметилформами- да 4,734 г СН Арг(Тос)-Д-Лей-Арг(Тос)- -NHj, полученного каталитическим .вос- Q становлением (Тос)-Д-Лей- -Арг{Тос)-Ш в присутствии Pd/C, 2,918 г БОК-Арг(Тос)ОН и 1,1 N-гидро- ксибензотриазола. К этому раствору при охлаждении льдом добавляют 1,543 г

0

перемешивают в холодильнике в течение суток и затем при комнатной температуре в течение суток. Образовавшийся таким образом осадок отфильтровывают и фильтрат концентрируют. Остаток очищают хроматографически на колонке с силикагелем (элюент: смесь метанол/ /хлороформ 1/15) и отверждают эфиром, получая 4,917 г БОК-Арг(Тос)- -СН,Арг(Тос)-Д-Лей-Арг(Тос)-МН,. Т.пл. 131-13б с (разложение).

ТСХ: Rf 0,44 (метанол/хлорофорй 1/7). Оптическое вращение: (a)j, -16,7° (, метанол).

Вычислено, %: С 51,32; Н 6,76; N 16,43.

Csi itsNuOnS,-

Найдено, %: С 51,15; Н 6,54; ,48.

Г. Синтез БОК-Цис(СНзБзл)-Арг(Тос.) 7СН5Арг(Тос)-Д-Лей-Арг(Тос)-НКа.

V Растворяют в 4 мл диметилформами- да 747 мг ВОК-Цис-(СН,Бзл)-ОН, Раст- вор охлая цают до -20 С и в него добавляют 0,254 МП N-метилморфолина и 0,221 мл этилового эфира хлоруголь- ной кислоты. Через 5 мин в раствор добавляют раствор 2,497 г Арг(Тос)-СН Арг(Тос)-Д-Лей-Арг(Тос)- -NHij, синтезированного путем обработки БОК-Арг-(Тос)-СН,Арг(Тос)-Д-Лей- Apr(Toc)-NH,j, трифторуксусной кислотой в присутствии анизола иО,277мп N-метилморфолина в 6 мл диметилформа мида, и смесь перемешивают в течение 2 ч приблизительно при -5°С. После концентрирования смесь растворяют в этилацетате и затем промывают раство ром гидрокарбоната натрия и водой . последовательно. После дополнительного концентрирования продукт отвержда ют смесью метанола и эфира, получая 2,548 г БОК-Цис(СН5Бзл)-Арг(Тос)- -СН,Арг(Тос)-Д-Лей-Арг(Тос)-Ш2.Т.пл. 126-132 0 (разложение).

ТСХ: Rf 0,51 (метанол/хлороформ 1/7), Оптическое вращение: (а). -20,6 (, метанол).

Вычислено, %: С 52,81; Н 6,82; N 14,66.

С q, N 150 ,э S4 СН ОН Н2.0

Найдено, %: С 52,78; Н 6,43; N 14,29.

Д. Синтез БОК-Фен-Цис(СНэБзл)- Apr(Тос)-СН,Арг(Тос)-Д-Лей-Арг(Тос)-NH..

Растворяют в диметилформамиде 467 мг БОК-Фен-ОН. Раствор охлаждают до и в него добавляют 0,194 мл N-метилморфолина и 0,168 мл этилового эфира хлоругольной кислоты. Через 5 мин в смесь добавляют раствор 2,234 г СР,СОрН-Н-Фен-Цис(СНзБзл)- Apr(Тос)-СН,Арг(Тос)-Д-Лей-Арг(Тос)- -NHj, синтезированного путем обработки БОК-Фен-Цис(СН,Бзл)-Арг(Тос)- (Toe)-Д-Лей-Apr(Toe)-NH трифторуксусной кислотой в присутствии анизола, и мл N-метилморфолина в 5 МП диметилформамида, и смесь перемешивают в течение .2 ч при температуре -5 с. После концейтрирования ос

таток растворяют в этилацетате, и раствор промывают водным раствором гидрокарбоната натрия и водой последовательно. После дополнительного концентрирования продукт отверждают добавкой смеси метанола к эфира, получая 2,126 г БОК-Фен-Цис(СН5Бзл)- Арг(Тсс)-СН Apr(Toe)-Д-Лей-Apr( -Ш. Т, пл. 124-130 С (разложение).

ТСХ: значение Rf 0,56 (метанол/ /хлороформ 1/7). Оптическое вращение: (a)j5 -18,9 (, метанол).

Вычислено, %: С 54.,83; Н 6,89; N .

,60i4Sv 5/2CH,OH

Найдено., %: С 54,62; Н 6,34; N 13,64.

Е. Синтез БОК-Д-Цис-(СН Бзл)-Гли- -OC,lH5.

Растворяют в 15 мл диметилформамида 3,233 г БОК-Д-Цис(СН,Бзл)-ОН.Раствор охлаждают до и в него добавляют 1,1 мл N-метилморфолина и 0,956 мл этилового эфира хлоругольной кислоты. Через 5 мин к этому раствору добавляют раствор 1,396 г НСГ Н-Гли-ОС Ну и 1,1 мл Н-метилмор- фолина в 20 мл диметилформамида, и смесь перемешивают в течение 2 ч при температуре около -5 с. После концентрирования остаток растворяют в этил- ацетате, и раствор промывают последовательно водным раствором гидрокарбоната натрия и водой. После концентрирования к остатку добавляют н-гексан, чтобы вызвать затвердевание продукта. Таким образом получают 3,6 г БОК-Д- Цис-Гли-ОС КS-. Т.пл. 80-82 С.

ТСХ: значение Rf 0,74 (хлороформ/ /этилацетат 2/1). Оптическое вращение: (a)jj +30,2 (, метанол).

Вычислено, %: С 58,51; Н 7,37; N 6,82.

Найдено, %: С 58,35; Н 7,23} N 6,69.

Ж. Синтез БОК-Тир()-Д-Цис - (СН, Бзл ) -Гли-OCjH 5-.

Растворяют 2,068 г БОК-Тир()- -ОН в 20 мл тетрагидрофурана. Раствор охлаждают до -20 С и добавляют в него 0,517 мл N-метилморфолина и 0,45 мл этилового эфира хлоругольной кислоты. Через 5 мин в этот раствор добавляют раствор 1,94 г CFjCOOH-H-Д-Цис (СН,Бзл)- Гли-ОС Ну, синтезированного путем обработки БОК-Д-Цис(СН,Бзл)-Гли-ОС4Н, трифторуксусной кислотой в присутстВИИ анизола, и 1 мл триэтил ат-гана в 20 мл тетрагидрофурана, и смесь перемешивают в течение 2 ч при температуре около -5 С. После концентрирования s К остатку добавляют воду, чтобь обра- э|овался осадок, который отфильтровы™ Е|ают и растворяют в смеси метанола и з лороформа. После концентрирования к остатку добавляют эфир, чтобы выз 10 Еать затвердевание продукта. Таким сбразом получают 2,661 г С1, Бэл)-Д-Цис(СН,Взл)-Гли-ОС Н5.

15

149-150 С.

ТСХ: значение Rf 0,63 (хлороформ/ этиладетат 2/1), Оптическое вращение: (а).р +17, (, диметилфор-.. амид),

Вычислено, %: С 59,01; Ы 5,91; 5,73,

.

Найдено, %: С 58,94; Н 5,75; 5,62.

Растворяют в 30 мл тетрагидрофура- ija 2,345 г ВОК-Тир(С15.Бзл)-Д-15ис ()-Гли-ОС Н5 и затем добавляют

раствор 3j2 МП 1 и, раствора гидро- ксида натрия. Смесь переме1Г1ивают при 1|:омнатной температуре в течение 1 ч 4 добавляют к ней 3,2 мл 1 н. соляной 1|сислоты. Полученную смесь концентри- .фуют. К остатку добавляют воду, чтобы продукт отвердел. Таким образом получают 1,899 г БОК-Тир()-Д- Цис()-Гли-ОН. Т.пл, 133-138°С (разложение).

ТСХ: значение Rf 0,25 (метанол/ /хлороформ 1/7). Оптическое враще- ше: (a)j, +3 5,8° (, метанол).

Вычисл-eHOs %: С 57,95; Н .5,58; N 5,96.

,..

Найдено, %: С 57,81; Н 5,33; N 5,92,

И„ Синтез БОК-Тир()-Д-1Ь1С (СН|Бзл)-Гли-Фен-Цис(СН,Бзл)-Apr(Toe) CHj Apr (Тос)-Д-Лей--Арг (Тос)-Шг.

Растворяют 983 мг БОК-Тир()- Д-Цис(СНзВзл)-Гли-ОН и 226 мг N-гид- роксибензотриазола в 5 мл диметилфор- мамида. При охлаж,а;ении льдом в раствор добавляют 316 мг дициклогексил- :карбодиимида. -После перемешивания в течение 2 ч в этот раствор добавляют раствор 1,94 г .Н-Фен-Цис , (СН5Бзл)-Арг(Тос)(Тос)-Д--Лей20

35

40

45

50

55

обработки БОК-Фен-Цис(СНзВзл)-Арг (Трс)-Д-Лей-Apr(Тос)-Ш2 трифторук- .сусной кислотой в присутствии анизола S и 0,167 МП N-метилморфолина в 10 мл диметилформамида, и смесь перемешивают в холодильнике в течение ночи, Полученньй таким образом осадок фильтруют. После хроматографической очистки на колонке с силикагелем (элюируемой смесью метанол/хлороформ 1/20) с последующим отвержде- кием смесью метанол/эфир получают 2,0 г БОК-Тир()-Д-Цис.(СН,Бзл)- Гли-Фен-Цис(СНзБзл)-Арг(Тос)-СН5Арг (Тос)-Д-Лей-Арг(Тос)-Ш2., Т.пл, 123- 130 с (разложение),

ТСХ: значение Rf 0,63 (метанол/ /хлороформ 1/7), Оптическое вращение: (а)и -17j5° (, диметилфор- мамид).

Вычислено, %: С 56,60;-Н 6,52; N 11,89.

C,,2,N,,0 gSyCLi-CjHjOCjH53/2CK Найдено, %: С 56,38; Н 6,18; N 11.,,72,

К, Синтез Тир-Д-Цис-Гли-Фен-ЦисАрг-СН рг-Д-Лей-Арг-МН.

Растворяют 515 мг БОК-Тир()-Д-Цис(СНзБзл)-Гли-Фен-Цис(СНзБзл)- Арг(Тос)-С% Apr(Toe)-Д-Лей-Apr(Toe)- -NHj в 20 мл фтористоводородной кислоты в присутствии 5 мл анизола при-5 С в реакционном сосуде 5 герметичном для фтористого водорода(HF).Раствор перемеши вают в течение 2 ч,и затем отгоняют HF водорода (HF), Раствор перемешивают в течение 2 ч, и затем отгоняют HF из реакционной системы. Остаток промывают эфиром и растворяют в воде, Раствор обрабатывают смолой Амберлит 1РА-93 (уксусно-кислый тип) и затем сушат вымораживанием. Растворяют 320 мг высушенного продукта в 1,3 л воды и раствор.подщелачивают до рН 8 водным аммиаком. Затем в раствор вводят воздух при перемешивании в течение 2 суток, и смесь подкисляют до рН 6 и. затем сушат вымораживанием, Полученньш таким образом неочищенный пептид очишдют методом жидкостной хроматографии высокого разрешения (фаза Нуклеосил 5 С 18, диаметр и длина колонки 2 и 25 см, элюент: 0505%-ный раствор НС1 в смеси вода/ /ацетонитрил 88/12) и сушат живанием, получая 140 мг Тир-Д ЦисApr(Toc)-NH, синтезированного путем , Гли-Фен-Цис-Арг-СНзАрг-Д-Лей-Арг-НН,

s 0

5

0

5

0

5

0

5

обработки БОК-Фен-Цис(СНзВзл)-Арг (Трс)-Д-Лей-Apr(Тос)-Ш2 трифторук- .сусной кислотой в присутствии анизола S и 0,167 МП N-метилморфолина в 10 мл диметилформамида, и смесь перемешивают в холодильнике в течение ночи, Полученньй таким образом осадок фильтруют. После хроматографической очистки на колонке с силикагелем (элюируемой смесью метанол/хлороформ 1/20) с последующим отвержде- кием смесью метанол/эфир получают 2,0 г БОК-Тир()-Д-Цис.(СН,Бзл)- Гли-Фен-Цис(СНзБзл)-Арг(Тос)-СН5Арг (Тос)-Д-Лей-Арг(Тос)-Ш2., Т.пл, 123- 130 с (разложение),

ТСХ: значение Rf 0,63 (метанол/ /хлороформ 1/7), Оптическое вращение: (а)и -17j5° (, диметилфор- мамид).

Вычислено, %: С 56,60;-Н 6,52; N 11,89.

C,,2,N,,0 gSyCLi-CjHjOCjH53/2CK Найдено, %: С 56,38; Н 6,18; N 11.,,72,

К, Синтез Тир-Д-Цис-Гли-Фен-ЦисАрг-СН рг-Д-Лей-Арг-МН.

Растворяют 515 мг БОК-Тир()-Д-Цис(СНзБзл)-Гли-Фен-Цис(СНзБзл)- Арг(Тос)-С% Apr(Toe)-Д-Лей-Apr(Toe)- -NHj в 20 мл фтористоводородной кислоты в присутствии 5 мл анизола при-5 С в реакционном сосуде 5 герметичном для фтористого водорода(HF).Раствор перемешивают в течение 2 ч,и затем отгоняют HF водорода (HF), Раствор перемешивают в течение 2 ч, и затем отгоняют HF из реакционной системы. Остаток промывают эфиром и растворяют в воде, Раствор обрабатывают смолой Амберлит 1РА-93 (уксусно-кислый тип) и затем сушат вымораживанием. Растворяют 320 мг высушенного продукта в 1,3 л воды и раствор.подщелачивают до рН 8 водным аммиаком. Затем в раствор вводят воздух при перемешивании в течение 2 суток, и смесь подкисляют до рН 6 и. затем сушат вымораживанием, Полученньш таким образом неочищенный пептид очишдют методом жидкостной хроматографии высокого разрешения (фаза Нуклеосил 5 С 18, диаметр и длина колонки 2 и 25 см, элюент: 0505%-ный раствор НС1 в смеси вода/ /ацетонитрил 88/12) и сушат живанием, получая 140 мг Тир-Д Цис ,1А3

ТСХ: значение Rf 0,56 (бутанол/ /уксусная кислота/пиридин/вода 15/5/5/8). Оптическое вращение; (a)j, -29 (,4, 0,01 н. HCl). Масс-спектр (FAB): 1183 (M+H). Ами- нокислотный анализ: Гли 1,02(1); Цис 1,83(2); Лей 1,04(1); Тир 0,80(1); Фен 1,00(1); Apr 2,66(2);Цис, обус- лоеленный СН,Арг, не рассчитывался.

Примеры 3-29. Приведенные в табл. 1 соединения синтезирозань аналогичным обычным жидкофазным способом, как в примерах 1 и 2. В этих экспериментах производные динорфина, модифицированные в положениях 1-3 (Тир-Гли-Гли), в положениях 4-7 (Фен- Лей Арг-Арг), в положениях 4-8 (Фен- Лей-Арг-Илей) и в положениях 4-9

Пример

СН ТирСН,ТирСН,ТирСН Тир-СН5Тир- СН,Тир- СН,Тир- Тир -Л - СН,ТирCHjTHp-

В

Гли-Гли-Фен- Гли-Гли-Фен- Тли-Гли-Фен- Тли-Гли-Фен- Тли-Гли-Фен- Тли-Гли-Фен Тли-Гли-Фен- Тли-Гли-Фен- Тли-Гли-Фен

Тли-Гли-Фен{Цис- Гли-Фен-Гли-Гли-Фен-Тли-Гли-ФенА

Тли-Гли-Фен- -Гли-Гли-Фен5. 2

(Фен-Лей-Арг-Арг-Лей-Арг), синтези- .рованы стадийным способом, исходя из С-терминальной группы в каждом пептиде. Затем эти производные в положениях 1-3 и производные в положениях 4- 7, 4-8 или 4-9 конденсировали совместно по методу дициклогексилкарбоди- имидов или методом смешанного ангидрида. Все защищающие группы удаляют фтористым водородом (HF), и продукт очищают методом препаративной жидкостной хроматографии вьзсокого разрешения, используя носитель обратимой фазы. В примере 13 все защищающие группы удалены KF, а соединение окислено воздухом и затем очищено методом препаративной жидкостной хроматографии высокого разрешения.

Таблица 1

Соединение

F

NH

-Д-Лей-ОН -Д-Лей-ОС Ну -Д-Лей-Ш -Д-Лей-ШС Н5.

СД Е

Лей- Apr-Apr

-Лей-Арг-АргЛей-Арг-Арг-Лей-Арг-АргЛей-Арг-Apr(napa-NO) -Лей-Арг-Д-Лей-Ш. -Лей-СН-Арг-Арг-Д-Лей-Ш, -Лей-Арг-СН-Арг-Д-Лей-Ш

(пара-Ш4)-Лей-Арг-СНзАрг-Д-Лей-ШС.гН -Лей-Лиз-СН-Арг-Д-Лей Ш, с Арг-СН, Арг-Д-Лей-ШС Н -Лей-Арг-Арг-Д-Лей-Арг-Ш -Лей-Арг-СН-Арг-Д-Лей-Арг-ШС Н у

ВС Д Е :

- (napa-NO,j) -Лей-Арг-ОН-Арг-Д-Лей-Арг-Ш -Мет(0)-Арг-СН5Арг-Д-Лей-Арг-НН2

Трет-Лей: (СН),ОСН.(МН)СООН

Гомо Apr: N Н4С(«МН)ШСН СН4СН СН СН(Ш4)СООН

Фен (пара-Ш)N02- -CH2CH(NH2) СООН

Сар:

В табл. 2 перечислены соединения, состав, величины угла оптического полученные в условиях предлагаемого 15 вращения и значения Rf. способа, с указанием аминокислотногс

...«.

.Таблица2

Примечание. В аминокислотном анализе рассчитывают соотношение только

аиинокислот: Гли,Лей, Фен, Apr, Ала, Тир, Лиз, Сер, Цис и Глу.

г.о - определение С « 0,4 н, НС1. Определение значения Rf в ТСХ: бутанол/уксусная кислота/пнрндин/вода- - 15/5/5/8.

Результаты испытаний на животных иллюстрируют эффективность соединений в качестве обезболивающих агентов.

Испытание 1. Испытание на обезболивание. Испытываемое соединение растворяют в физиологическом солевом растворе и вводят его внутривенно или подкожно самцам мьппей линии ddy (вес тела 20-27 г, при изучении обычно разбивают на группы по 8). Обезболивающую активность измеряют в испы

тании с ущемлением хвоста.

В этом испытании ущемление хвоста в основании хвоста, включая анальную слизистую оболочку, помещают зажим, развивающий давление около 300 г, и измеряют латентность кусания этого зажима. До эксперимента проводили отбор животных на ноцицептивность зажима хвоста, причем исключали из эксперимента тех мышей, которые не кусали зажим в пределах 3 с. В качестве критерия обезболивания применяли латентность, превьппающую 6 с.

Величины EjtjQ (доза, вызьшающая 50% обезболивания) рассчитывают по методу Литчфилда и Уилкоксона. Результаты показаны в табл. 3 (при внутривенной инъекции) и в табл. 4 (при подкожной инъекции).

Таблица 3

16

Продолжение табл.3

-

14

15

16

17

Динорфин (1-13)

1,8 0,7 0,7 2,0 более 25,0

15

Таблица 4

соепри

Ущемление хвоста ЕДдо, мг/кг (подкожно)

25

5

0

5

0

5

Испытание 2. Опиоидная активность. Опиоидные активности соединений определяют по предлагаемому способу с использованием семенного канала кролика. В этом испытании взрослых самцов кроликов умерщвляют, вводя воздух в ушную вену. Сразу после смерти проводят лапаротомию и удаляют правый и левый семенные каналы. Семя вьздавли- вают из каналов в раствор Ринджера. Каждый канал нарезают на части (2,5см длиной от конца со стороны предстательной железы). Эти кусочки семенного канала суспендируют с помощью винта в стеклянной ячейке емкостью 6 мл при постоянной температуре и стимулируют электрическим стимулятором, имеющим платиновые электроды при следующих условиях: частота 0,1 Гц, 1 млс и 90 В. Сокращение, вызванное электрическим стимулированием, записывают через преобразователь.

Опиоидную активность определяют на основании ингибирования сокращения, вызванного электрическим стимулированием.

Результаты представлены в табл. 5 в единицах концентрации 50%-ного ин- гибирования (ЙКуд).

Таблица 5

Из табл. 5 очевидно, что соединения предлагаемого способа проявляют весьма большую активность по сравне- нию с динорфином А. Кроме того, они имеют высйкне активности при ингиби- ровании сокращения илеальных продольных мышц морской свинки и семенных каналов мьппи, .вызванного электричес- КИМ стимулированием.

Пептидные соединения, полученные в условиях предлагаемого способа, обладают опиоидными активностями, аналогичными активности динорфина, при- чем их действие является весьма сильным, проявляются значительные обезболивающие эффекты при внутривенной инъекции или подкожной инъекции.

Очень ценно, что соединения, получанные по предлагаемому способу проявляют сильное обезболивающее действие при систематическом введении посредством внутривенной или подкожной инъекции, в то время как динорфин и его производные обладают едва заметным обезболивающим действием при внутривенной инъекции, поскольку эти соединения нестабильны в крови.

Соотношение между токсичностью (минимальная летальная доза) пептидных соединений, полученных в примерах 1 и 2, и эффективной.дозой показано в табл. 6.

Таблица 6

Таким образом, соединения, полученные в условиях предлагаемого способа, могут быть отнесены к категории среднетоксичных и обладают более высокой анальгетической активностью, чем динорфин.

Формула изобретения

Способ получения пептидов общей формулы

Rf

г

X

LTyr-А-Uly--В - С - D-Е-Т

где R, г водород или один из R, и R - водород, другой С -С -алкил; А - Gly D-Cys, связанный

с С, если С - Cys; Б - Phe, (n-N02)Phe; С - Leu, Met(O), Суз, связанный с А, если А - D Cys;

D - Arg, CH,Arg, Lys; E - Arg, CHjArg; F - NH, D-.eu-X, где X - OH, NHj, ., или D-Leu-Arg-X, где Х-Шд, ,

ОТЛИ1 чающийся тем, что осуществляют постепенное наращивани пептидной цепи, исходя из БОС защищенной С - конечной аминокислоты, с использованием для активации карбоксильных групп карбодиимидного метода и метода смешанных ангидридов и от полученного защищенного пептида, в случае необходимости, отщепляют, имеющиеся защитные группы.