Способ количественного определения веществ, способных к ферментативному окислению в водном растворе Советский патент 1977 года по МПК G01N27/48 

(54) СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВЕЩЕСТВ, СПОСОБНЫХ К ФЕРМЕНТАТИВНОМУ ОКИСЛЕНИЮ В ВОДНОМ РАСТВОРЕ

2 содержащий 4 ммоль сульфата магния, 0,44 ммоль NAflP и 0,59 ммоль АТР. Пробы сыворотки, в которой определяют содержание Д-глюкозы, вводят с интервалом 1 мин. Пробы 1-7 содержат 200, 100, 1ОО, 200, ЗОО, 50 и 50 мг глюкозы в 100 мл сьшоротки соответственно Получена прямая пропорциональная зависимость (вплоть до концентрации 200мг /100 мл) между содержанием Д-глюкозы в пробе и количеством образовавшегося МАДРН (см. фиг. 1 и фиг. 2) П р и м е р 2. Определение Д-глюкозы в сыворотке проводят аналогично примеру 1, но в буферный раствор вводят дополнительно 0,12 мг/мл гексокиназы с ак тивностью 16,5 ед/мл и 0,12 мг глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы с активностью 17 ед/мл, и получают сходные результаты П р и м е р 3, Определение гексокина зы в водном растворе протекает но схеме Д-глюкоза + АТР гексокиназа глюкозо I,1--. -6-фосфат + АДР, глюкозо-6-фосфат- NAДP + глюкозо-в-фосфатдегидрогеназа 6-фосфоглюконат + МАДРН + Н Поскольку промежуток времени между началом реакции и измерениями на детекторе постоянный, то по количеству образовавшегося ЫАДРН можно судить об активности гексокиназы. Колонку заполняют глюкозо-6-фосфатде гидрогеназой, набухшей в воде, на носите ле с удельной активностью 27 ед/мл. Ме ду детектором и резервуаром располагают стеклянную спираль (внутренний диаметр 2,5 см, длина пробега 70 см), которую нагревают до 95 С в водяной бане. На спирали происходит инактивация ранее измеренной гексокиназы. В качестве буферного раствора применяют 0,ЗМ триэтаноламинный буфер (рН 7 содержащий 4 ммоль сульфата магния 0, ммоль МАДР, 0,59 ммоль АТР и 20% глюкозы. Пробы водного раствора гексокиназы вводят с интервалом 1 мин. Используют разбавление 1:2 и 1:4, а также неразбавленный раствор гексокиназы (0,1 мг протеина .и 1 мл). Между концентрацией гексокиназы и показаниями самописца наблюдается линейная зависимость (см. фиг. 3). П р и м е р 4, Определение Д-глюкозы в сыворотке с помощью глюкозокси- дазы протекает по схеме: Д-глюкоза + H-jO глюкозоксидаза глюконовая кислота + И.О. Колонку заполняют глюкозоксидазой с удельной активностью 200 ед/г, набухшей Б воде, на носителе. В качестве детектора применяют продажные электроды, чувствительные к кислороду, в сочетании с прибором для измерения количества кислорода. Скорость обтекания электрода 7,5 см/сек, диаметр входного отверстия в проточной ячейке 1 мм. В качестве буферного раствора применяют 0,2М раствор фосфата калия, содержащий 18 ммоль иодида калия, 7,5 ммоль пентамолибдата аммония и 80О ммоль хлорида натрия. Пробы сыворотки вводят с интервалом 1 мин. Пробы 1-7 содержат 1ОО, 1ОО, 100, 200, 300,400 и 50О мг глюкозы в 100 мл сыворотки соответственно. Результаты опытов приведены на фиг.4 и фиг. 5. П р и м е р 5. Определение мочевой кислоты протекает но схеме: мочевая кислота + 2Н.О + О уреказаа лантоин + , + СХ) . Колонку заполняют уреказой на носителе с удельной активностью 3 ед/мл. Диаметр колонки 1 см, высота заполнения 5см. Скорость обтекания электрода 3,5см/сек, диаметр входного отверстия в проточной ячейке 1 мм. В качестве буферного раствора применяют 0,2М раствор бората (рН 6,5), в котором растворено 60О ед/мл уреказы. Пробы раствора, в котором определяют содержание мочевой кислоты, вводят с интервалом 6 мин. Пробы 1-6 содержат 5, 10, 15, ЗО, 45 и 60 мг мочевой кислоты в 10О мл пробы соответственно. Формула изобретения Способ количественного определения веществ, способных к ферментативному окислению в водном растворе путем введения анализируемой пробы в водный буферный раствор циркуляции полученного раствора через колонку, заполненную энзимом, связанным с носителем, с последующим анализом буферного раствора, например определением содержания кислорода в нем известным методом, отличающийся тем, что, с целью повышения точности анализа и ускорения его, анализируемую пробу вводят в поток буерного раствора порциями при постоянной корости потока и циркуляции буферного расвора с постоянной скоростью.

Показания сатписца 0025 мгг/гаомл 1г 57 Номер пробы

Показания сапописца

0,175 50100

200250

Кон14енп7ра14ая

IPU8.2 мг/юо njt Показания сспописца

//7 fcTdSaS effue5 67 Нопер nflodb/

100 200 .ff

00 500 600 KoHiieHmflaifi/fi / е/юопл