Способ оценки стресс-устойчивости животных Советский патент 1980 года по МПК A01K67/00 A61B5/16 G01N33/50 

Изобретение относится к области экспериментальной биологии и медицины, конкретно к методам отбора живот ных для эксперимента, и может быть использовано для выявления устойчивых животных к действию шокогенной травмы. Известен способ оценки стрессустойчивости животных по реакции напряжения задней части тела в ответ на ггшатановый наркоз. Однако данный способ не позволяет выявлять животных, устойчивых к дейс вию шокогенной травмы. Наиболее близким к изобретению по технической сущности является способ определения функциональных возможнос тей организма по уровню ферментной активности сыворотки крови животных, заключающийся в том, что определяют активность в крови кре.атинфодфокиназы, лактатдегидрогеназы, щелочной фосфотазы, аспартатаминотрасфенаэы и у-глутамилтрансферазыи по изменению уровня активности ферментов по сравнению с нормой оценивают функциональ ные возможности организма. Однако данный способ также не обе печивает отбора животных, устойчивых к шокогенной травме. Целью изобретения является разработка способа выявления животных, устойчивых к действию шокогенной травмы. Цель достигается способом, заключёкядимся в том, что у животного при его иммобилизации исследуют в лейкоцитах и эритроцитах периферической крови комплекс субстратов и ферментов обмена глюкозы и ГЛЮКОЗО-6-ФОСфатдегидрогеназы, гёксокиназы и показателей окислит€ льно-врсстановительных процессов: содерясаниё лактата, акг тивности цитохромоксидазы, и по увеличению показателей активности указанных ферментов и содержания субстрата в лейкоцитах соответственно на 50-55, 60-65% и 60-70%, 70-100%, в эритроцитгос соответственно на 70-80%, 60-100% и 40-50%, 180-300% по сравнению с исходным уровнем судят об устойчивости зкивотных к шокогенной травме.. Способ ос5пцествляют следующим образом. Отобранное для опыта животное, например собака (беспородная), осматривается ветеринаром с целью выбраковывания животных с наличием патологии: устанавливается 63paidT/rf вес. У собаки из бедренной вены забирается кровь в обычных спокойных уело вйдх - контроль. После этого собака фиксируется на столе с помощью намордника, прикрепленного к столу, и лямок, надетых на,лапы в положении йа спине - иммобилизацибйнбй стресс. С момента полной фиксации начинаете отсЧет времени. В первые 5 иммобилиэационного стресса у животного путем пункции через кожу из задней вены голени забирается 10 мл крОвй в центрифужные пробирки с 0,2 мл гепарина (SOOO ме/мл) . Для предотвращения образовайия сгустков крови содержимое пробирки осторожно перемешивается. Кровь центрифугируется при 1000 об/мин в течение 30 мин для получения плазмы. Плазма отсасывается. Для получения осадка лейкоцитов плaз ма центрифугируется при 1000 об/мин, в течение 12 мин и очищается физиологическим раствором от примесей эритро цитов , Полученная плотная масса клеток гомогенизируется с 3,5 мл дистиллированной воды. В 0,1 мл гомогената определяется содержание белка. Эритроциты промываются несколько раз равными объемами физиологического р аствораИплсзтно центрифугируются . при ЗООО об/мин, 1-2 мм верхнего слоя отбрасывается. Приготавливается гемолиз ат с дистиллированной водой в соот ношении 1:20. В 0,02 мл гемолизата определяется гемоглобин. Расчет опредёляёмых субстратов и ферментов, ведет ся на 1 г белка лейкрцитов и на 1 г гемоглобина. В приготовленные пробирки с субстратными смесями для определения ферментов ра.зносится по 0,2 мл лязата лейкоцитов или гемолизата. Для определения лактата отбирается соответственно 0,2 мл биологического Материала и фиксируется 0,5 мл 20%-ной сернокислой медью, Лактат определяется в реакции с параоксидифенилом (1,5% раствором) по методу описанному М.И.Прохоровой и З.Н.Тупиковой, Большой практикум по углеводному и лицидному обмену, Л., 1965. Для определения активности глюкозо-б-фосфатдегидрогеназы отбирают О,2 мл биологического материала и помещают в инкубационную смесь, содержащую 0,2 мл НАДФ (1,5 мг/1 мл), 0,2 мл сернокислого магния (120 мг в 1 мл) и 0,4 мл глюкозо-6-фосфата (22 мг/1 мл) и ТРИС-буфер рН-8,5. Инкубация 20 мин при З7с. Ферментативная реакция прекращается добавлением 1 мл раствора щелочи. Для определения активности гексокиназы биологический материал 0,2 мл помещают в инкубационную смесь, со- держащую 0,2 мл НАДФ (1,5 мг/мл), . 0,2 мл сернокислого магния(120 мг/мл), 0,2 мл глюкозы (2,4 мг/мл) и 0,4 мл АТФ (3,1 мг/мл), 1 мл ТРИС-буфера рН-7,5. Инкубация 10 мин при . Ферментативную реакцию прекращают добавлением 1 мл 1,2 М раствора щелочи. Затем все пробы спектрофотометрируют на СФ-4 при 340 нм. Результаты выражают в Мйкромолях НАДФ (мин) 1 г. Оценка способности клетки акцепти.ровать кислород ведется путем определения aikTHBHOCTH цитохромоксидазы: для этого 0,2 млобиологического материала помещают в среду, содержащую 0,5 мл обратного буфера, рН 9,0, 0,2 МП цитохрома С (0,4 мг/мл) и окрашивают 0,4 мл диметилпарафенилендиамйнгидрохлорида (4 мг/мл), инкубация 10 мин при- . Результаты выражают (В.С.Асатиани, 1969) в условных бптическйх единицах на 1 г (экстинция, полу.ченная на СФ-4). Установлено, что у устойчивых к шоку собак уровень активности ферментов утилизации глюкозы (глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы и гексокиназы), и показателей окислительно-восстановительных процессов (уровень лактата и активность цитохромоксидазы) после 5-минутного иммобилизационного стресса в лейкоцитах соответственно выше на 50-55%, 60-65% и 60-70%, 70-100%, в эритроцитах - на 70-80%, 60-100% и 40-50%,180-300% по сравнению с даннйми контроля. Пример 1. Собака Чернушка, вес 16 кг. Проведен осмотр ветеринаром. Признаков явной паталогии не наблюдсшось. Кровь забиралась до и после 5-минутного иммобилизационного стресса и в лейкоцитах и эритроцитах определялась активность гл окозо-6-фосфатдегидрогеназы, гексокиназы, цитохромоксидазы и уровейь лактата. Результаты определения сведены в табл.1. Таблица 1

Глюкозо-6-фосфат- ,, - дегидрогеназа 10,1 100 64,0 100 15,7

Гексоки8,0 100 49,0 100 12,7 58,7 104,5 113,2 наза 55,4 108,9 70,2 0,41 100 2,4 100 0,71 Лактат Цитохромоксидаэа 3,20 100 1,84 100 6,40

Повышение уровня исследуемых пока зателей в клетках .крови после 5-минутного иммобилизационного стресса свидетельствует о том, что исследуемое животное является устойчивым к действию шокогенной травмы. Действительно, при нанесении стандартной травмы по Кеннону (200 ударов по внутренней поверхности верхней трети бедра) у собаки Чернушки после подъема артериального давления ДО 230-240 VM рт.ст. регистрировалась кратковременная гипотония (50/55 мм pTiCT.), после чего уровен Глюкозo-6-фocфaтдегидроге11,7 100 68,7 100 7,3 наза Гексо7,7 100 56,0 100 4,0 киназа 0,37 100 2,83 100 0,18 Лактат Цитохро3,97 100 5,7 моксидаза

Понижение уровня исследуемых показателей в клетках крови,забранной -у собаки Рыжик после 5-минутного иммобилизационного стресса, свидетельствует о том, что исследуемое животное является неустойчивые к действию шокогенной травмы. Действительно, при нанесении стандартной тразгал по Кеннону (200 ударов по внутренней поверхности верхней трети бёдра у собаки Рыжик после кратковременного подъема артериального давления (220 мм рт.сТу развился тяжелый травь тический шок с выраженной шоковой гипотонией , (до 40-50 мм рт.ст.). Собака погибла через 90 мин после нанесения травмц.

Таким образом,предлагаемый способ позволяет, основываясь на уровне биоПродолжение табл.1

магистрального артериального давле- 15 ния стабилизировался (70-80 мм рт.ст.). Собака вышла из июкового состояния.

Пример 2. Собака 1Рыжик, вес. 16,5 кг. Проведеносмотр ветеринаром; 20 Признаков явной патологии не наблюда|ется. Кровь забирсшась до и после 15-минутного иммобилизационного стресса и в лейкоцитах и эритроцитах определялась гштивность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, гексокииазы, цйтохро- .

25 моксидазы и уровень лактата. Результаты определения сведены в табл.2.

Т а б .л и ц а 2. 1,70

химических показателей в эритроцитах и лейкоцитах, активностн глюкозо-6-/ -фосфатдегидрогеназы,гексокиназы,цитогфомоксидазы и уровня лактата после S MHHyTtioro шдаобидизационного стресса, производить отбор устойчивых особей к действию шокогенной травмы.

Выявление исходного уровнярезистентности организма к шокогенным воздействиям с помощью предлагаемого способа икюет важное значение с целью выработки рекомендаций для практического здравоохранения. Учет индивидуальных особенностей пострадавшего необходим для оценки реакции на травму и разработки методов противошоковой терапии. 73,2 3,51 46,3 100 7,60 313,0 .37,6 57,6 48 51 1,8 69 57

Формула изобретения

Способ оценки стресс-устойчивости животных путем определения биохи ческих показателей крови до и после иммобилиэационного стресса, о т л и чающийся тем, что, с целью выявления животных, устойчивых к шокогенной травме, в лейкоцитах и эритроцитах крови определяют активность

глюкоэо-б-фосфатдегидрогеназы, гексокиназы, цитохромоксидазы и уровень лактата и по увеличению этих показателей после иммобилизацнонного стрес са в лейкоцитах соответственно на 50-55%, 60-65%, 60-70%,70-100%; в эритроцитах - на 70-80%,60-100%, 40-50%, 180-300% по сравнению с исходным уровнем, животных считают стресс-устойчивыми.